课题3　分解纤维素的微生物的分离优秀教学设计

分解纤维素的细菌的分离的复习和练习

养马中学 张洋

讲考纲

微生物的培养、分离与应用，了解微生物的培养、分离与应用。

讲考情

考查角度

微生物的分离与培养

某种微生物数量的测定

选择培养基的选择作用

讲基础

一、微生物的培养

1．培养基

（1）概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。

（2）营养组成：一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。此外，还需要满足微生物生长对pH、氧气以及特殊营养物质的要求。

（3）种类：按照物理性质可分为液体培养基和固体培养基。

2．无菌技术

（1）含义：指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。

（2）关键：防止外来杂菌的入侵。

（3）不同对象的无菌操作方法

考频

5年5考

5年3考

5年4考

3．大肠杆菌的纯化培养

（1）制备固体培养基：计算→称量→溶化→灭菌→倒平板。

（2）纯化大肠杆菌

①平板划线法：是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。

②稀释涂布平板法：是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。

4．菌种的保存方法

①对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。

②对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。

二、微生物的利用

1．土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

（1）分离原理：土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起到催化作用。

（2）统计菌落数目：统计样品中的活菌一般用稀释涂布平板法。

（3）实验流程：土壤取样→样品的稀释→微生物的培养与观察→细菌的计数。

2．分解纤维素的微生物的分离

（1）纤维素酶

①组成：纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。

②作用

（2）纤维素分解菌的筛选

①原理

②筛选方法：刚果红染色法，即通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

③培养基：以纤维素为唯一碳源的选择培养基。

④实验流程

土壤取样（富含纤维素的环境）→选择培养（用选择培养基培养，以增加纤维素分解菌的浓度）→梯度稀释（制备系列稀释液）→涂布平板（将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上）→挑选产生透明圈的菌落。

讲素养

1．科学思维：分析培养基的成分及其作用，比较平板划线法和稀释液布平板法的异同，选择培养基和鉴别培养基的差别。

2．科学探究：设计实验探究微生物培养的条件。

3．社会责任：关注有害微生物的控制及宣传健康生活。

讲典例

【例1】下列有关微生物培养的叙述正确的是（

）

A. 通常使用液体培养基分离获得细菌单菌落

B. 若培养基需要调节pH，应该在灭菌后进行

C. 用显微镜直接计数固体培养基中微生物数量

D. 倒置平板可防止培养基被滴落的冷凝水污染

【答案】D

【例2】临床使用抗生素前，有时需要做细菌耐药实验。实验时，首先要从病人身上获取少量样本，然后按照一定的实验步骤操作，以确定某致病菌对不同抗生素的敏感性。

回答下列问题：

（1）为了从样本中获取致病菌单菌落，可用__________法或__________________法将样本接种于固体培养基表面，经过选择培养、鉴别等步骤获得。

（2）取该单菌落适当稀释，用__________法接种于固体培养基表面，在37 ℃培养箱中培养24 h，使其均匀生长，布满平板。

（3）为了检测该致病菌对于抗生素的敏感性，将分别含有A、B、C、D四种抗生素的滤纸片均匀置于该平板上的不同位置，培养一段时间后，含A的滤纸片周围出现透明圈，说明该致病菌对抗生素A________________；

含B的滤纸片周围没有出现透明圈，说明该致病菌对抗生素B____________；含C的滤纸片周围的透明圈比含A的小，说明_______________________________；含D的滤纸片周围的透明圈也比含A的小，且透明圈中出现了一个菌落，在排除杂菌污染的情况下，此菌落很可能是抗生素D的_________________。 （4）根据上述实验结果，为达到抗菌目的，最好应选用抗生素__________。

【答案】（1）平板划线

稀释涂布（平板）（或涂布）

（2）涂布

（3）敏感

不敏感

该致病菌对C的敏感性比对A的弱

耐药菌

（4）A 【解析】（1）在微生物的培养过程中，常用来分离微生物的方法是稀释涂布（平板）法或平板划线法。

（2）为了使微生物在培养基上能够均匀分布，一般用涂布法将微生物接种在培养基上。

【例3】牛奶是微生物培养的良好培养基，牛奶在饮前都要经过巴氏消毒，以杀死有害微生物，为检测消毒

前后牛奶中细菌含量变化情况，做如图所示操作。用无菌吸管从锥形瓶中吸取1 mL生牛奶稀释液至盛有9 mL无菌水的试管中，混合均匀，如此再重复2次。请回答下列有关问题：

（1）巴氏消毒的方法是____________，使用这种方法对生鲜牛奶进行消毒的好处是_____________。

（2）取最终的牛奶稀释液0.1 mL滴在培养基上进行涂布，应选择的涂布工具是________。

（3）消毒后的牛奶中绝大部分细菌被杀死，若继续用该方法检测消毒后的牛奶中细菌的数量，则在操作步骤上应做什么改动？____________。

（4）从生牛奶取样培养得到的菌落中混有各种杂菌，从中检测出大肠杆菌的方法是在培养基中加入_______，菌落具有________特征的可以认定为大肠杆菌。

【答案】（1）在70～75 ℃煮30 min（在80 ℃煮15 min）

牛奶的营养成分不被破坏

（2）涂布器

（3）减少稀释次数

（4）伊红美蓝

（金属光泽的紫）黑色

【解析】（1）采用巴氏消毒法加工牛奶，在70～75 ℃煮30 min 或80 ℃煮15 min进行杀菌，此种方法在杀灭牛奶中有害微生物的同时牛奶的营养成分不被破坏，完好地保存了营养物质和纯正口感。

（2）取最终的牛奶稀释液0.1mL滴在培养基上进行涂布，应选择涂布器。

（3）消毒后的牛奶中绝大部分细菌被杀死，若继续用稀释涂布平板法检测消毒后的牛奶中细菌的数量，则在操作步骤上应减少稀释次数。

（4）欲检测大肠杆菌，可在培养基中加入伊红美蓝，大肠杆菌菌落会呈黑色，略带金属光泽。

【例4】已知微生物A可以产生油脂，微生物B可以产生脂肪酶。脂肪酶和油脂可用于生物柴油的生产。回答有关问题：

（1）显微观察时，微生物A菌体中的油脂通常可用_________染色。微生物A产生的油脂不易挥发，可选用____________（填“萃取法”或“水蒸气蒸馏法”）从菌体中提取。

（2）为了从自然界中获得能产生脂肪酶的微生物B的单菌落，可从含有油料作物种子腐烂物的土壤中取样，并应选用以___________为碳源的固体培养基进行培养。 （3）为了确定微生物B产生的脂肪酶的最适温度，某同学测得相同时间内，在35 ℃、40 ℃、45 ℃温度下降解10 g油脂所需酶量依次为4 mg、1 mg、6 mg，则上述三个温度中，________℃条件下该酶活力最小。为了进一步确定该酶的最适温度，应围绕________℃设计后续实验。

【答案】（1）苏丹Ⅲ（或苏丹Ⅳ）

萃取法

（2）油脂（其他合理答案也可）

（3）45 40

（3）在45 ℃下，降解10 g油脂所需酶量最多，则该温度下酶活性最低；由题干信息可知，40 ℃下降解10 g油脂所需的酶量最少。应围绕40 ℃设置不同温度梯度来探究酶的最适温度。

讲方法1．培养基的配制原则

（1）目的要明确：配制时应根据微生物的种类、培养目的等确定配制的培养基种类。

（2）营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。

（3）pH要适宜：细菌为6．5～7．5，放线菌为7．5～8．5，真菌为5．0～6．0，培养不同微生物所需的pH不同。

2．微生物对主要营养物质的需求特点

（1）自养型微生物所需的主要营养物质是无机盐，碳源可来自大气中的CO2，氮源可由含氮无机盐提供。

（2）异养型微生物所需的营养物质主要是有机物，即碳源必须由含碳有机物提供，氮源也主要是由有机物提供，部分异养型微生物也可以利用无机氮源。

3．判断培养基制作与接种操作是否合格的方法

（1）从培养基制作是否合格上判断：如果未接种的培养基在恒温箱中保温1～2 d后无菌落生长，说明培养基的制备是成功的，否则需要重新制备。

（2）从接种操作是否符合无菌要求上判断：

①如果培养基上生长的菌落的颜色、形状、大小基本一致，并符合接种菌菌落的特点，说明接种操作是符合要求的。

②如果培养基上出现了其他菌落，则说明接种过程中，无菌操作未达到要求，需要分析原因，重新操作。

4．选择培养基的制作方法

（1）在培养基全部营养成分具备的前提下，加入物质：依据某些微生物对某些物质的抗性，在培养基中加入某些物质，以抑制不需要的微生物，促进所需要的微生物生长，如培养基中加入高浓度食盐时可抑制多种细菌的生长，但不影响金黄色葡萄球菌的生长，从而可将该菌分离出来；而在培养基中加入青霉素时可抑制细菌、放线菌的生长，从而分离得到酵母菌和霉菌。

（2）通过改变培养基的营养成分达到分离微生物的目的：培养基中缺乏氮源时，可分离自生固氮微生物，非自生固氮微生物因缺乏氮源而无法生存；培养基中若缺乏有机碳源则异养微生物无法生存，而自养微生物可利用空气中的CO2制造有机物生存。

（3）利用培养基的特定化学成分分离特定微生物：如当石油是唯一碳源时，可抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，从而分离出能消除石油污染的微生物。

（4）通过某些特殊环境分离微生物：如在高盐环境中可分离耐盐菌，其他菌在盐浓度高时易失水而不能生存；在高温环境中可分离得到耐高温的微生物，其他微生物在高温环境中因酶失活而无法生存。

讲易错

1．微生物培养的“三点提醒”

（1）培养基中营养物质的确定方法。

①自养型微生物所需的主要营养物质是无机物，碳源可来自大气中的CO2，氮源可由含氮无机盐提供。

②异养型微生物所需的营养物质主要是有机物，即碳源必须由含碳有机物提供，氮源也主要由有机物提供，部分异养型微生物也可以利用无机氮源。

（2）选择无菌技术的原则。

①考虑无菌技术的效果：灭菌的效果比消毒要好。

②考虑操作对象的承受能力：活体生物材料、操作者的手等只能采用消毒，而不能灭菌。

（3）纯化大肠杆菌的两种方法的异同。

①相同点：平板划线法和稀释涂布平板法都能获得单细胞菌落。

②不同点：平板划线法不能对微生物计数，而稀释涂布平板法能对微生物计数。

2．关于“选择菌落数在30～300的平板”的两个理解误区

（1）只得到1个菌落数在30～300的平板：不符合实验的重复原则，易受到偶然因素的影响。

（2）得到3个或3个以上菌落数在30～300的平板：也不一定正确，如得到3个平板，菌落数分别为230、34、240，虽然菌落数均在“30～300”，但由于34与另外两个平板上的菌落数差异较大，应找出原因并重新实验。