课题3　分解纤维素的微生物的分离板书设计及意图

课题3分解纤维素的微生物的分离

1．纤维素酶是复合酶，包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶等组分。

C1酶和Cx酶葡萄糖苷酶2．纤维素酶的作用：纤维素――――→纤维二糖――――→葡萄

糖。

3．刚果红与纤维素形成红色复合物。当纤维素被分解后，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。

4．分离分解纤维素的微生物的实验流程：土壤取样―→选择培养―→梯度稀释―→将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上―→挑选产生透明圈的菌落。

5．分离后，为确定得到的是纤维素分解菌，还需进行发酵产纤维素酶的实验。

纤维素酶及纤维素分解菌的筛选

[自读教材·夯基础]

1．纤维素

(1)基本组成单位：葡萄糖。

(2)含量：是地球上最丰富的多糖类物质。

(3)分布：棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物。此外，木材、作物秸秆等也富含纤维素。

2．纤维素酶

(1)组成：纤维素酶是一种复合酶，至少包括三种组分，即C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶。

(2)作用：

纤维素――→纤维二糖――→葡萄糖

(3)实验验证：

试管

滤纸条

缓冲液pH＝4.8 纤维素酶(70～80 U/mL) 1 1 cm×6 cm 10 mL 1_mL 将两支试管固定在50 mL的锥形瓶中，在摇2 1 cm×

6 cm 3.纤维素分解菌的筛选

(1)方法：刚果红染色法，常用的有两种。一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜床上以140 r/min的转11 mL

速振荡反应1 h 完全

分解

基本

无变化

条件

结果

C1酶和Cx酶葡萄糖苷酶

色反应；另一种是在倒平板时就加入刚果红。

(2)原理：

[跟随名师·解疑难]

纤维素分解菌的筛选

(1)筛选原理：

刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖反应。当纤维素被纤维素酶分解后，该复合物无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。

(2)筛选方法：

操作

优点

方法一

先培养微生物，再加入刚果红

显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用

方法二

倒平板时加入刚果红

操作简便，不存在菌落混杂的问题

①由于在纤维素粉、琼脂和土豆汁中都含有淀粉类物操作繁琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂

质，可以使能够产生淀粉酶的微生物出现透明圈较为模糊的假阳性反应

②有些微生物具有降解色素的能力，长时间培养会降解刚果红而形成明显的透明圈

实验设计和课题延伸

[自读教材·夯基础]

1．实验设计流程

缺点

2．课题延伸——纤维素分解菌的鉴定

(1)为确定得到的透明圈中的菌落是纤维素分解菌，需要进行发酵产纤维素酶的实验。纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵两种。

(2)纤维素酶的测定方法，一般是采用对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量测定。

1．阅读教材P29旁栏中的纤维素分解菌选择培养基的成分回答下列问题。

(1)旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？

提示：是液体培养基，因为配方中无凝固剂。

(2)这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果有，是如何进行选择的？

提示：有选择作用。本配方中的唯一碳源是纤维素粉，所以能分解纤维素的微生物可以大量繁殖，而不能分解纤维素的微生物被抑制。

(3)你能否设计一个对照实验，说明选择培养的作用？

提示：用接种了的牛肉膏蛋白胨培养基进行对照，若牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数大于选择培养基上的菌落数，说明选择培养基具有筛选作用。

2．在实验过程中，为什么要进行梯度稀释？

提示：通过梯度稀释使聚集在一起的微生物分散成单个细菌，在培养基表面形成单个的菌落。

3．分离分解纤维素的微生物实验，只是分离纯化的第一步，为确保得到的是纤维素分解菌，还需要做什么工作？

提示：还需要进行发酵产纤维素酶的实验。

[跟随名师·解疑难]

1．纤维素分解菌的筛选过程中所用两种培养基的成分和作用

(1)纤维素分解菌的选择培养基：

组分

纤维素粉

NaNO3

Na2HPO4·7H2O KH2PO4

MgSO4·7H2O KCl 酵母膏

水解酪素

含量

5 g 1 g 1.2 g 0.9 g 0.5 g 0.5 g 0.5 g 0.5 g 特殊营养成分、碳源、氮源

氮源、特殊营养成分

无机盐

提供的主要营养物质

碳源、能源

上述物质溶解后，用蒸馏水定容至1 000 mL

(2)鉴别纤维素分解菌的培养基：

组分

CMCNa 酵母膏

KH2PO4

琼脂

土豆汁

含量

5～10 g 1 g 0.25 g 15 g 100 mL 提供的主要营养物质

碳源

碳源、氮源、特殊营养成分

无机盐

凝固剂

碳源

上述物质溶解后，用蒸馏水定容至1 000 mL 2.纤维素分解菌的筛选过程中所用两种培养基的比较

(1)纤维素分解菌的选择培养基为液体培养基，利用液体培养基能使营养成分充分消耗，以增加纤维素分解菌的浓度。

(2)纤维素分解菌的鉴别培养基为固体培养基，因为需要在培养基上形成我们肉眼可见的菌落。

(3)在上述选择培养基中能以纤维素作为碳源和能源的微生物可以正常生长，而其他绝大多数微生物不能正常生长；而在上述鉴别培养基中，绝大多数微生物都可以正常生长。

[特别提醒]

(1)判断某个培养基是否具有选择作用时，应设立基础培养基进行对照。

(2)判断所使用的培养基是否被杂菌污染时，应设立不接种该菌种的培养基进行空白对照。

刚果红染色法分析

[例1]

下列有关刚果红染色法的叙述，错误的是(

)

A．刚果红可以在细菌菌落形成前倒平板时加入

B．刚果红可以在菌落形成后加入

C．在菌落形成前倒平板时加入，刚果红不需要灭菌

D．在菌落形成后加入刚果红时，刚果红不需要灭菌

[解析]

利用刚果红筛选纤维素分解菌时，刚果红可以在细菌菌落形成前倒平板时加入，也可以在菌落形成后加入。在细菌菌落形成前倒平板时加入，要进行灭菌，以防杂菌的侵入，影响纤维素分解菌菌落的形成；在菌落形成后加入刚果红，则不需要灭菌。

[答案]

C 实验的拓展应用

[例2]

某实验小组欲从土壤中筛选出能分泌淀粉酶的芽孢杆菌，设计实验步骤如下，请给予合理的补充。

(1)采样与培养：将采集的土样混匀后称取1 g，置于经过________________法灭菌处理的________(填“固体”或“液体”)培养基中，28 ℃振荡培养。

(2)接种与选择：为避免培养液中菌体浓度过高，需将培养液进行________处理。之后，将菌液涂布接种于以________为唯一碳源的固体培养基上，30 ℃条件下培养。为避免污染，需将培养皿呈________状态放置。此外，为排除其他因素的影响，提高实验可信度，本步骤需设计________________________作为空白对照。

(3)筛选与纯化：将适量的碘液滴加在平板中的菌落周围，如果菌落周围的现象是________________，则说明此种菌能够____________________________。从平板中挑取实验效果明显的目的菌株，采用____________法接种于新的培养基平板上，可对菌株进行进一步的纯化。

[解析]

(1)对培养基的灭菌方式是高压蒸汽灭菌，因为后面要进行涂布，所以应该用液体培养基来培养。(2)减小培养液菌体浓度一般用稀释方法。由于题目要求选出能分泌淀粉酶的芽孢杆菌，所以培养基中的碳源就应只有淀粉。倒置可以减少培养基受污染，为排除其他因素影响，需要设置未接种的空白的培养基作对照组。(3)淀粉被水解，培养基会出现透明圈的现象。用平板划线法来培养，可进一步纯化菌种。

[答案]

(1)高压蒸汽灭菌

液体

(2)系列稀释(或梯度稀释)

淀粉

倒置

未接种的空白培养基(或接种等量无菌水的培养基) (3)出现透明圈

分泌淀粉酶使淀粉发生水解

平板划线

归纳拓展

选择培养的“浓缩”作用

在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。

[随堂基础巩固]

1．下列关于纤维素的叙述错误的是(

) A．纤维素是由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物

B．纤维素能被土壤中某些微生物分解利用，是因为这些微生物能产生纤维素酶

C．植物的根、茎、叶等器官都含有大量的纤维素

D．自然界中的各种生物均能把纤维素分解成葡萄糖，从而作为生物体的能量来源

解析：选D

自然界中许多生物都不能分解纤维素，只有能合成纤维素酶的生物才能分解纤维素。

2．在加入刚果红的培养基中会出现透明圈，产生的透明圈是(

) A．刚果红与纤维素形成的复合物

B．刚果红与纤维二糖形成的复合物

C．纤维素分解后形成的葡萄糖导致的

D．以纤维素分解菌为中心形成的

解析：选D

刚果红可以与纤维素结合形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红－纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。

3．微生物体内能够使纤维素分解成纤维二糖的酶是(

) A．C1酶和Cx酶

B．C1酶和葡萄糖苷酶

C．Cx酶和葡萄糖苷酶

D．C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶

解析：选A

纤维素酶包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶。前两种酶将纤维素分解为纤维二糖。

4．纤维素酶的测定方法一般是(

) A．对纤维素进行定量测定

B．对纤维素酶分解纤维素后所产生的葡萄糖量进行测定

C．对纤维素酶分解纤维素后所产生的纤维二糖进行定量测定

D．对纤维素分解菌进行定量测定

解析：选B

纤维素分解菌的鉴定常用发酵产纤维素酶的实验，即对纤维素酶分解纤维素后所产生的葡萄糖进行定量测定。

5．(2014·新课标Ⅰ)植物秸秆中的纤维素可被某些微生物分解。回答下列问题：

(1)分解秸秆中纤维素的微生物能分泌纤维素酶，该酶是由3种组分组成的复合酶，其

中的葡萄糖苷酶可将________分解成________。

(2)在含纤维素的培养基中加入刚果红(CR)时，CR可与纤维素形成________色复合物。用含有CR的该种培养基培养纤维素分解菌时，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的________。

(3)为从富含纤维素的土壤中分离获得纤维素分解菌的单菌落，某同学设计了甲、乙两种培养基(成分见下表)：

培养基甲

培养基乙

酵母膏

＋

＋

无机盐

＋

＋

淀粉

＋

＋

纤维素粉

＋

－

琼脂

－

＋

CR溶液

＋

＋

水

＋

＋

注：“＋”表示有，“－”表示无。

据表判断，培养基甲________(填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是____________________________________；培养基乙________(填“能”或“不能”)用于分离和鉴别纤维素分解菌，原因是____________________________________________ ________________________________________________________________________。

解析：(1)纤维素酶包括三种组分，即C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，C1酶、Cx酶催化纤维素分解成纤维二糖，葡萄糖苷酶将纤维二糖分解成葡萄糖。(2)CR能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，CR—纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌的菌落为中心的透明圈。(3)培养基甲中未添加琼脂，为液体培养基，液体培养基上不能形成单菌落，故不能用于分离和鉴别纤维素分解菌。培养基乙中未添加纤维素，不能和CR形成红色复合物，即使出现单菌落也不能确定为纤维素分解菌。

答案：(1)纤维二糖

葡萄糖

(2)红

透明圈

(3)不能

液体培养基不能用于分离单菌落

不能

培养基中没有纤维素，不会形成CR—纤维素红色复合物，即使出现单菌落也不能确定其为纤维素分解菌

[课时跟踪检测]

(满分50分

时间25分钟) 一、选择题(每小题3分，共24分) 1．在加入刚果红的培养基中出现透明圈的菌落是(

) A．分解尿素的细菌

C．分解纤维素的细菌

B．硝化细菌

D．乳酸菌

解析：选C

分解纤维素的细菌能将纤维素分解，则刚果红－纤维素的复合物就无法形成，培养基中就会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈。

2．使用刚果红染色时，加入刚果红应在(

) ①制备培养基时

②梯度稀释时

③倒平板时

④涂布时

⑤长出菌落时

A．①③

C．③⑤

B．②⑤

D．④⑤

解析：选C

常用的刚果红染色法有两种：一种是先培养微生物，长出菌落后再加入刚果红进行颜色反应；另一种是倒平板时就加入刚果红。最终，两种染色法都可以在培养基上观察到以纤维素分解菌为中心的透明圈。

3．下列关于纤维素酶的叙述，错误的是(

) A．纤维素酶只有一种，只能将纤维素分解为葡萄糖

B．纤维素酶是一种复合酶，至少包括C1、Cx和葡萄糖苷酶三种

C．纤维素可被纤维素酶水解成葡萄糖，为微生物提供营养物质

D．分解纤维素的细菌、真菌、放线菌，都是通过产生纤维素酶来分解纤维素的

解析：选A

纤维素酶是一种复合酶，一般认为至少包括三种组分，C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶。其中C1酶和Cx酶将纤维素分解为纤维二糖，葡萄糖苷酶将纤维二糖分解为葡萄糖。纤维素可以为以纤维素为碳源的真菌、细菌、放线菌提供营养物质。

4．分离土壤中纤维素分解菌用到的方法是(

) ①稀释平板法

②涂布平板法

③单细胞挑取法

④选择培养分离法

A．①②

C．②③

B．②③④

D．①③④

解析：选B

分离土壤中的纤维素分解菌，先进行选择培养，增加纤维素分解菌的浓度，然后梯度稀释，涂布平板、培养，最后单细胞挑取以获得纯种培养。稀释平板法是先进行梯度稀释，然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50 ℃左右的琼脂培养基混合摇匀后，倾入灭菌的培养皿中，制成可能含菌的琼脂平板，保温一定时间即可出现菌落。但此方法只适用于耐高温微生物的分离，不能用来分离纤维素分解菌。

5．要将能分解纤维素的细菌从土壤中分离出来，应将它们接种在(

) A．加入指示剂的鉴别培养基上

B．含有蛋白胨的固体培养基上

C．只含纤维素粉而无其他碳源的选择培养基上

D．含四大营养要素的培养基上

解析：选C

分解纤维素菌的选择条件是以纤维素为唯一碳源。

6．下列关于分离纤维素分解菌实验过程的操作，有误的是(

) A．经选择培养后将样品直接涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上

B．富集培养这一步可省略，但培养的纤维素分解菌少

C．经稀释培养后，用刚果红染色

D．对照组可用同样量的培养液涂布到不含纤维素的培养基上

解析：选A

经选择培养后，再经稀释，才能将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上；富集培养可省略；经稀释培养后，用刚果红染色；设置对照能证明经富集培养的确得到了欲分离的微生物。

7．利用农作物秸秆为原料可生产乙醇，生产过程中可采用微生物将秸秆水解或用酶水解，其主要技术流程如下图所示，下列相关说法错误的是(

) 秸秆―→秸秆碎屑反应罐水解压滤出渣酒精发酵真空分馏

A．可用刚果红染色法筛选过程①所需的纤维素分解菌

B．过程①加入的纤维素酶是葡萄糖苷酶

C．酒精发酵接种的酵母菌需在无氧条件下发酵

D．酒精发酵前需对培养基进行高压蒸汽灭菌

解析：选B

筛选纤维素分解菌可采用刚果红染色法；纤维素酶为复合酶，至少包含三种组分，C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶；酒精发酵需在无氧条件下进行；酒精发酵前需对培养基进行高压蒸汽灭菌。

8．下表资料表明在各种培养基中细菌的生长情况，(S、C、M)为简单培养基，U、V、X、Y、Z代表加入培养基的不同物质，问哪一种物质细菌不能合成(

) 培养基

S、C、M S、C、M＋V＋Z S、C、M＋U＋Y S、C、M＋Z＋X S、C、M＋V＋Y S、C、M＋U＋X S、C、M＋Y＋Z 生长状态

－

－

＋

－

＋

－

＋

注：表中“＋”表示能生长，“－”表示不能生长。

A．U

C．Y

B．V D．Z 解析：选C

从表中可以看出，凡是能生长的均有Y，而不能生长的均无Y。因此，Y是细菌不能合成的物质。

二、非选择题(共26分) 9．(12分)有些微生物能合成纤维素酶，通过对这些微生物的研究和应用，使人们能够利用秸秆等废弃物生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。研究人员成功地从土壤中筛选到能产生纤维素酶的微生物。分析回答问题：

(1)在将样品稀释涂布到鉴别培养基之前，可以通过______(填“固体”或“液体”)培养基进行______以增加纤维素分解菌的浓度。

(2)刚果红可以与纤维素等多糖形成红色复合物，但并不与纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。常用的刚果红染色法有两种，第一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应；第二种是在________时就加入刚果红。________(填“第一种”或“第二种”)方法会使菌落之间发生混杂。

(3)如果观察到产生________的菌落，说明可能获得了纤维素分解菌。为了确定是纤维素分解菌，还需要进行________产纤维素酶的实验。纤维素酶的测定方法一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的________进行定量的测定。

(4)实验结束后，使用过的培养基应该进行灭菌处理才能倒掉，这样做的目的是________________________________________________________________________。

解析：(1)在将样品稀释涂布到鉴别培养基之前，可以通过液体培养基进行选择培养以增加纤维素分解菌的浓度。

(2)常用的刚果红染色法有两种，一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，另一种是在倒平板时就加入刚果红。但第一种方法会使菌落之间发生混杂。

(3)如果观察到产生透明圈的菌落，说明可能获得了纤维素分解菌。为了确定是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验。纤维素酶的测定方法一般是采用对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定。

(4)实验结束后，使用过的培养基应该进行灭菌处理才能倒掉，以免菌种对环境造成污染。

答案：(1)液体

选择培养

(2)倒平板

第一种

(3)透明圈

发酵

葡萄糖

(4)防止造成环境污染

10．(14分)进入冬季，部分城市出现严重雾霾，与秸秆野外焚烧有一定关系。为破解秸秆处理瓶颈，微生物专家力图通过微生物降解技术使秸秆能尽快腐烂掉，增加土壤肥力。缓解环境污染。试分析并回答有关问题：

(1)专家研制的降解秸秆的催腐剂是十余种能分解纤维素的霉菌、细菌和酵母菌的组合。其中________在细胞结构上与其他两者不同。

(2)纤维素酶是一种复合酶，其中的葡萄糖苷酶可以将__________分解为______________。

(3)微生物专家为从发黑的树干上分离出有分解纤维素能力的高产菌株，制备了选择培养基，将菌液进行一系列__________，从而得到单个菌落，再采用_________________法进行鉴定，得到如图所示的菌落。那么，图中降解纤维素能力最强的菌株是___________(填图中序号)。

(4)图中所示培养基从物理状态上看，属于____________培养基。

(5)为探究催腐剂在不同条件下对玉米秸秆的分解作用，将经过灭菌处理的秸秆平分成下表的甲、乙、丙三组，均放在无菌环境条件下进行培养，得到如下实验现象：

组别

甲

乙

丙

该实验还存催腐剂

无

有

有

温度/℃

25 25 35 实验现象

第25天落叶还没变化

第25天落叶完全腐烂

第18天落叶完全腐烂

在不完善之处，请说出其中一点______________________________________________________________。

解析：(1)霉菌和酵母菌属于真核生物中的真菌，细菌属于原核生物，原核细胞和真核细胞在结构上最主要的区别是原核细胞没有核膜包被的成形的细胞核。(2)纤维素酶是一种复合酶，其中的葡萄糖苷酶可以将纤维二糖分解为葡萄糖。(3)将菌液进行一系列梯度稀释，可以得到单个菌落，再采用刚果红染色法进行鉴定。纤维素酶的量越多，活性越强，分解的纤维素越多，透明圈越大，所以图中降解纤维素能力最强的菌株是①。(4)图中所示培养基从物理状态上看，属于固体培养基。(5)设计实验应遵循单一变量和对照性原则，分析实验表格可知，该实验还存在不完善之处，即缺少35 ℃无催腐剂的对照组。

答案：(1)细菌

(2)纤维二糖

葡萄糖

(3)梯度稀释

刚果红染色

①

(4)固体

(5)缺少35 ℃无催腐剂的对照组

培养基与微生物的分离

一、培养基的类型和作用

划分标准

培养基种类

液体培养基

物理性质

半固体培养基

固体培养基

加凝固剂，如琼脂

特点

不加凝固剂

用途

工业生产

观察微生物的运动、分类、鉴定

微生物分离、鉴定、活菌计数、保藏菌种

含化学成分不明确的天然物质

培养基成分明确(用合成培养基

化学成分已知的化学物质配成) 微生物的分类、鉴别

工业生产

天然培养基

化学

成分

允许特定种类的微选择培养基

生物生长，同时抑制或阻止其他微生物生长

根据微生物的代谢鉴别培养基

特点，在培养基中加入某种指示剂或化学药品

二、微生物的分离与鉴定

培养、分离出特定微生物，如培养酵母菌或霉菌，可在培养基中加入青霉素；培养金黄色葡萄球菌，可在培养基中加入高浓度食盐

鉴别不同种类的微生物，如用伊红—美蓝培养基鉴别饮用水或乳制品中是否有大肠杆菌(若有，菌落呈深紫色，并带有金属光泽) 用途

微生物的分离方法有很多种，本专题中常用的是：平板划线法、稀释涂布平板法、微生物的选择培养等。针对不同微生物的特点选择不同的方法，对目的微生物进行筛选。以下是尿素分解菌和纤维素分解菌的分离与鉴定比较。

项目

分离选择条件

尿素分解菌的分离与鉴定

利用尿素为唯一氮源

细菌等微生物合成脲酶，将尿素分鉴定原理

解产生NH3，使pH升高，加入酚红变红色

纤维素分解菌的分离与鉴定

利用纤维素为唯一碳源

分解纤维素的微生物产生纤维素酶，将纤维素分解为纤维二糖或葡萄糖，使纤维素—刚果红复合物降解而出现透明圈

土壤取样→制备培养基→选择培养→富集培养→梯度稀释→涂布培养→刚果红染色→挑取菌落→进一步鉴定

1．下列有关细菌培养的叙述，正确的是(

) A．在琼脂固体培养基上长出的单个菌落含有多种细菌

B．在培养基中加入青霉素可抑制真菌而促进细菌生长

C．向液体培养基中通入氧气能促进破伤风杆菌的生长

D．在半固体培养基中接种细菌培养后可以观察其运动

解析：选D

单个菌落中只含有一种细菌；青霉素抑制细菌生长，而对真菌没有影响；破伤风杆菌是厌氧型细菌，通入氧气会抑制其生长。

2．生物乙醇是以生物为原料生产的可再生能源。我国利用农作物废弃物(秸秆)生产乙醇，其技术流程为纤维素酶分解―→酵母菌发酵―→蒸馏―→成品。纤维素酶可以从能分解纤维素的细菌培养液中提取。某同学设计了从土壤中分离纤维素分解菌的实验流程：土壤土壤取样→制备培养基→样品梯步骤

度稀释→涂布平板→培养观察→进一步鉴定

取样―→选择培养―→梯度稀释―→鉴别培养。请分析回答下列问题。

(1)最好选择________________环境采集土样。

(2)配制培养基时，各种成分在分装前必须进行________，接种前要进行____________。在整个微生物的分离和培养过程中，一定要注意在无菌条件下进行。在制备牛肉膏蛋白胨固体培养基的倒平板操作时，平板冷凝后，应将平板________放置，这样做的目的是_________________________________________________________。

(3)以下是两种培养基配方：

A．培养基配方：

KH2PO4

1.4 g B．培养基配方：

Na2HPO4·7H2O 1.2 g MgSO7H24·O 0.5 g 0.5 g KCl 纤维素粉

5 g 酵母膏

0.5 g 水解酪素

0.5 g Na2HPO4

2.1 g MgSO4·7H2O 0.2 g 纤维素酶

1 g 葡萄糖

10.0 g 尿素

1.0 g 琼脂

15.0 g KH2PO4

0.9 g NaNO3

1 g 如果要分离提纯土壤中的纤维素分解菌，应选择________(填编号)培养基配方，从功能看该培养基属于________培养基。

(4)为了鉴别纤维素分解菌和进一步纯化菌种，可以在鉴别培养基中加入__________，将筛选获得的菌液稀释后用__________法接种到鉴别培养基上，然后挑选产生________的菌落作为菌种进行进一步的扩大培养。

解析：纤维素分解菌生活在纤维素丰富的土壤环境，故应选择这样的环境采集土样。B培养基中纤维素是主要碳源，有利于纤维素分解菌生长，同时抑制其他微生物生长，能够分离提纯纤维素分解菌。在鉴别培养基上加入刚果红染液，可鉴别纤维素分解菌和进一步纯化菌种。将筛选获得的菌液稀释后用涂布平板法方法接种到鉴别培养基上，然后挑选产生透明圈的菌落作为菌种进行扩大培养。

答案：(1)纤维素含量丰富的土壤

(2)调整pH

高压蒸汽灭菌

倒过来

防止冷凝水污染培养基

(3)B

选择

(4)刚果红染液

涂布平板

透明圈

3．下面的甲图表示酵母菌、硝化细菌和乳酸菌在半固体培养基中的生长情况，乙图表示这三种菌的增殖速度与氧气浓度之间的关系，请据图回答：

(1)乙图中a、b、c三条曲线依次表示甲图________号试管中微生物在不同氧气浓度中的增殖速度。

(2)研究发现，青霉素能破坏细菌的细胞壁并在细菌细胞的繁殖期起杀菌作用。如果培养基中混杂了这三类微生物，请设计实验，利用改变培养基成分等培养条件，将酵母菌和硝化细菌分离出来。

①主要步骤：

a．分别配制不含____________的培养基(A)和加入____________的培养基(B)，分别灭菌。

b．分别接种混合液放在适宜条件下培养。

c．观察结果。

②结果：在A培养基上生存的是________，在B培养基上生存的是________。

(3)微生物培养过程中，获得纯净培养物的关键是________________________。

(4)若想对初步筛选得到的目的菌进行纯化并计数，可采用的接种方法是________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。

解析：从甲图试管中微生物的分布和数量分析，乳酸菌分布在缺氧的下层，酵母菌在缺氧的底部和氧含量高的上层均匀分布，而硝化细菌主要分布在上层，因此可以判断出a、b、c曲线表示3、2、1号试管中的微生物增殖速度。青霉素破坏细菌的细胞壁，而酵母菌属于真菌，青霉素不能起到杀灭的作用，硝化细菌属于自养生物，不需要添加葡萄糖作为能源物质和碳源。

答案：(1)3、2、1

(2)①有机碳源

青霉素

②硝化细菌

酵母菌

(3)防止杂菌污染(无菌技术)

(4)稀释涂布平板法