课题2　月季的花药培养教学设计(第二课时)

专题3·课题2 月季的花药培养

【课题目标】

说出被子植物花粉发育的过程及花药培养产生花粉植株的两种途径，说出影响花药培养的因素，学习花药培养的基本技术，尝试用月季或其他植物的花药进行培养。

【课题重难点】

1、重点：选取适宜的培养材料和培养基。

2、难点：选取适宜的培养材料和培养基。

【课题背景分析】

课题背景介绍了花药培养的历史以及花药培养在育种工作上的意义。有条件的学校可以引导学生尝试某种植物的花药培养。

【基础知识分析与教学建议】

（一）被子植物的花粉发育

知识要点：1、花粉是单倍体生殖细胞；2、花粉的发育要经历不同的时期。

教学建议：可以利用教材给出的“被子植物花粉的发育过程”的插图，帮助学生了解花粉发育所经历的不同时期，为后面实验材料的选取打下基础。

（二）产生花粉植株的两种途径

知识要点：花药培养产生花粉植株的两种途径。

教学建议：体细胞胚的概念是第一次出现，可以让学生重点阅读教材的楷体字部分，并结合流程图来认识花粉植株产生的两种不同途径。

（三）影响花药培养的因素

知识要点：选取适宜的材料和培养基组成是花粉植株诱导成功的关键。

教学建议：教师可以补充一些不同植物和不同花粉发育时期的花药培养的资料，帮助学生认识材料选择和培养基配方的重要性。

【实验安排及注意事项】

（一）本课题有一定难度，成功率较低。全部完成课题不仅耗时较长，又有季节限制。最好提前做好时间规划，以提高工作效率。建议教师提前一年摸索经验、总结教训，如花蕾的选择、培养基配方等。建议第一课时完成基础知识的教学，学习操作方法并制备培养基（或课后制作培养基）。第二课时学习花粉发育时期的鉴定。第三课时做花蕾的选择和灭菌、接种。花药培养的周期较长，成功的接种也要在培养20～30 d后才能见到愈伤组织或胚状体，且进一步的实验必须非常及时，因此，本课题的有些过程教师可以安排同学在课外做。

（二）最适宜的花药发育时期会因植物种类和品种的不同而不同，但对大多数植物而言，适宜进行花药培养的时期是单核居中期或单核靠边期。在花药培养中，要使所选材料的发育时期完全一致是很困难的。不仅不同花序在培养时期的进程并不完全同步，即使在同一花序上，不同花朵也有很大差异。这些需要靠不断实践，以积累经验。

（三）一定将事前设计好的培养基做好标号和记录。实验时不仅要有书面记录，还要用记号笔在三角瓶上标明标号。接种后要及时标明月季品种代号、操作者代号及接种日期等。可以几个同学合作，轮流做观察记录并及时沟通和交流。

【教学方法】

启发式，讲述法，实验法。

【教学准备】

课前做好实验材料的选择，PPT课件，课堂练习题。

【课时安排】

3课时（第1课时完成基础知识的教学，学习操作方法并制备培养基或课后制作培养基；第2课时学习花粉发育时期的鉴定；第3课时做花蕾的选择和灭菌、接种）。

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【教学过程】

课题背景：1964年，印度科学家在培养毛叶曼陀罗的花药时，首次获得了由花药中的花粉粒发育而来的单倍体植株。这个实验说明了什么呢？说明了生殖细胞和体细胞一样，在离体的条件下也具有发育成完整植株的潜能。自20世纪60年代以来，花药培养的研究发展迅速。据记载，世界上已有250多种高等植物的花药培养获得成功，其中小麦、玉米、大豆、甘蔗和橡胶等近50种植物的花粉再生植株已由我国科技人员首先培育成功。

植物的花药培养在育种上有特殊的意义。育种工作者可以采用花药离体培养的方法，使花粉粒发育为单倍体植株，再经过人工诱导使染色体数目加倍，重新恢复到正常植株的染色体数目。人工诱导染色体数目加倍的方法常用的是用一定浓度的秋水仙素溶液处理植物的幼苗或萌发的种子。这样的植株不仅能够正常生殖，而且每对染色体上的成对的基因都是纯合的，自交产生的后代不会发生性状分离。单倍体育种不仅缩短了育种周期，也为新品种的培育开辟了新途径。

（教师可先简讲一下单倍体育种的过程，并板书在黑板上，引导学生从培育过程中总结出单倍体育种的优缺点——优点：能明显缩短育种年限；缺点：技术要求高，难度大）

引入新课：在本课题中，我们将尝试月季的花药培养。

一、基础知识

（一）被子植物的花粉发育

被子植物的雄蕊由花药和花丝两部分组成，花药内有许多的花粉。花粉是由花粉母细胞经过减数分裂而形成的，因此花粉是单倍体的生殖细胞。

被子植物花粉的发育要经历小孢四分体期、单核期和双核期等阶段，如下图（用PPT课件展示）。

归纳图：

讲述：小孢子四分体时期：4个单倍体细胞（小孢子）连在一起。

单核期：四分体的4个细胞彼此分离，形成4个具有单细胞核的花粉粒，核位于细胞中央，称为单核居中期。随着细胞不断长大，细胞核由中央移向细胞一侧，称为单核靠边期。

双核期：单核靠边期的一个小孢子最后分裂成1个生殖细胞核和1个花粉管细胞核，该时期称为双核期。进而形成两个细胞，一个是生殖细胞，一个是营养细胞。生殖细胞将再分裂（有丝分裂）1次，形成2个精子（基因型相同）。

（二）产生花粉植物的两种途径

一般有两种途径：①花粉通过胚状体阶段发育为植株；②花粉在诱导培养基上先形成愈伤组织，再将其诱导分化成植株。如下图（用PPT课件展示）。

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讲述：这两种途径之间并没有绝对的界限，主要取决于培养基中植物激素的种类及其浓度配比。

人们一直以为，植物细胞的离体培养只能通过分别诱导芽和根等器官再发育成植株。20世纪50年代末，科学家在胡萝卜根组织的单细胞悬浮培养液中发现，某些体细胞在形态上转变为与合子（受精卵）发育成的胚非常相似的结构，它的发育过程也与合子胚类似，胚芽、胚根、胚轴等结构完整，就像一颗种子。科学家将这种结构称做体细胞胚，由于它像胚但不是胚，所以把它又取名为“胚状体”。

除了植物的体细胞外，由单倍体性细胞产生的花粉胚，也可发育成为单倍体植株。

教材P38旁栏“i”：

花期一般指在一个生长季内植株开花的时间段。比如某些各类的月季，从5月初一直到11月都连续开花。那么5月初就叫做该种月季的初花期或花期早期。花期早期的花蕾营养状态及生理状态会比较好，能提高花粉诱导成功率。

（三）影响花药培养的因素

诱导花粉植株能否成功及诱导成功率的高低，受多种因素影响。

1、材料的选择与培养基的组成是主要的影响因素。不同植物的诱导成功率很不相同。就同一种植物来说，亲本植株的生理状况对诱导成功也有直接影响。花期早期的花药比后期的更容易产生花粉植株。一般月季的花药培养时间选在5月初到5月中旬，即月季的初花期。

2、选择合适的花粉发育时期也是提高诱导成功率的重要因素。这是因为并不是任何时期的花粉都可以经过培养产生愈伤组织或胚状体，在花粉发育的过程中，只有某一个时间对离体刺激敏感。一般来说，在单核期，细胞核由中央移向细胞一侧的时期，花药培养成功率最高。选择单核期以前的花药接种，质地幼嫩，极易破碎；选择单核期以后的花药接种，花瓣已有些松动，又给材料的消毒带来困难。因此，为了挑选到单核期的花药，通常选择完全未开放的花蕾（见教材P39的图3－8，用PPT课件展示）。盛开的或略微开放的花（见教材P39图3－9，用PPT课件展示），都不宜选作实验材料。由此可见，一般月季的花药培养选择初花期、单核期、完全未开放的花蕾。

3、亲本植株的生长条件、材料的低温预处理以及接种密度等对诱导成功率都有一定的影响。

二、实验操作

（一）材料的选取

选择花药时，一般要通过镜检来确定其中的花粉是否处于适宜的发育期。一般来说，在单核期，细胞核由中央移向细胞的一侧，为此，通常会选择完全未开放的花蕾，成功率最高。确定花粉发育时期的最常用方法有醋酸洋红法，并将花粉细胞核（染色体）染成深紫色，能着色的为发育期的花粉；对于细胞核不易着色的花粉需采用焙花青－铬矾法，并将花粉细胞核染成蓝黑色，能着色的为发育期的花粉，采用此法时，需先将花药放在卡诺氏液中固定20min。

醋酸洋红法：将花药放在载玻片上，加一滴质量分数为1%的醋酸洋红，用镊柄将花药捣碎，盖上盖玻片后在显微镜下检查。醋酸法兰绒的配制方法是：将体积分数为45%的醋酸100mL煮沸，缓缓加入1g洋红，再加热回流（回流装置参见专题6课题2）8h，冷却至500C，过滤即可。

焙花青－铬矾法：花药应先在卡诺氏固定液中固定20min，然后取出放在载玻片上上，加焙花青－铬矾溶液染色，盖上盖玻片后在显微镜下检查。卡诺氏固定液的配制方法是：将无水酒精与冰醋酸按体积比为3∶1的比例混匀。焙花青－铬矾溶液的配制方法是：将5g铬钾矾加入90mL蒸馏水中，溶解后加入0.1g焙花青，混匀并加热至沸腾，煮沸5min后冷却到室温，过滤，加蒸馏水定容至100mL。

（二）材料的消毒

材料消毒过程中先用体积分数为70%的酒精溶液浸泡30s，立即取出，在无菌水中清洗。取出后，再用无菌吸水纸吸干花蕾表面的水分，再放入质量分数为0.1%的氯化汞溶液中2～4min（也可用质量分数为1%的次氯酸钙溶液或饱和漂白粉溶液），取出后再用无菌水冲洗3～5次。

（三）接种和培养

灭菌（应为消毒）后的花蕾，要在无菌条件下除去萼片和花瓣，并立即将花药接种到培养基上，尽量不损伤花药（否则接种后容易从受伤部位产生愈伤组织），同时还要彻底去除花丝（因为与花丝相连的花药不利于愈伤组织或胚状体的形成）。通常每瓶接种花药7～10个，培养温度控制在250C左右，不需要光照。幼小植株形成后才需要光照。长出愈伤组织或胚状体后，将愈伤组织及时转移到分化培养基上，以便

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进一步分化出再生植株。如果花药开裂释放出胚状体，则一个花药内就会产生大量的幼小植株，必须在花药开裂后将幼小植株尽快分开，分别移植到新的培养基上，否则这些植株将很难分开。

在花药培养中，特别是通过愈伤组织形成的花粉植株，常常会出现染色体倍性的变化。因此，还需要对培养出来的植株作进一步的鉴定和筛选。

教材P39旁栏“？”题：为什么花瓣松动会给材料的消毒带来困难？

答：花瓣松动后，微生物就可能侵入到花药内，给材料的消毒带来困难。

思考：植物组织培养技术与花药培养技术有何异同？

答：相同之处：培养基的配制方法、无菌技术及接种操作等基本相同。不同之处：花药培养的选材非常重要，需事先摸索出适宜的花蕾，再选择时期适宜的花蕾；花药裂开后释放出的愈伤组织或胚状体也要及时更换培养基；花药培养对培养基配方的要求更为严格。这些都使花药的培养难度加大。列表比较如下：

项目

植物组织培养技术

相同点

离体的植物组织经脱分化形成愈伤组织，再分化成丛芽，诱导生根，然后进行移栽

不同点

外植体为体细胞，染色体数无需加倍

取材为花药，培养的为单倍体幼苗，植株弱小，高度不育，必须用秋水仙素处理，使染色体加倍，恢复正常植株的染色体数，并且为纯种

花药培养技术

三、结果分析与评价

1、选材是否恰当：选材是否成功是花药培养成功的关键。学生应学会通过显微镜观察处于适宜发育期的花粉。

2、无菌技术是否过关：如果出现了污染现象，说明某些操作步骤，如培养基灭菌、花蕾消毒或接种等有问题。

3、接种是否成功：如果接种的花药长出愈伤组织或释放出胚状体，花药培养的第一步就成功了。要适时转换培养基，以便愈伤组织或胚状体进一步分化成再生植株。

布置作业：完成教材上的两道练习题。

教学后记：

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