课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数教学设计(第二课时)

课题2

土壤中分解尿素的细菌的分离和计数

成都市新都一中

鲁海荣

【教学目标】：

（1）知识与技能

利用选择培养基分离细菌，运用相关技术解决生产生活中有关微生物的计数

（2）过程与方法

分析研究思路的形成过程，找出共性和差异性

（3）情感、态度与价值观

形成无菌不在的概念，养成讲究卫生的习惯

【教学重点】：对土样的选取和选择培养基的配制

【教学难点】：对分解尿素的细菌的计数

【教学过程】：

一．课题背景：

（1）、尿素的利用

尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。

（2）、细菌利用尿素的原因：土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶

（3）、课题目的：①从土壤中分离出能够分解尿素的细菌

②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌

二.研究思路

㈠.筛选菌株

1、自然界筛选：

（1）含义：根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。

（2）实例：DNA多聚酶链式反应是一种在体外将DNA大量复制的技术，需要耐高温（930C）的DNA聚合酶。Taq细菌生活在热泉温度70～800C环境中，它进行DNA复制的酶必耐高温

2. 实验室筛选：

（1）含义：人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。

（2）选择培养基：在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。目的是从众多微生物中分离所需要的微生物。

（3）结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯化培养分离。

3、培养分解尿素的细菌的培养基：

（1）从物理性质看此培养基属于固体培养基

（2）在此培养基中碳源是葡萄糖、尿素，氮源是尿素

（3）、培养基选择出分解尿素的微生物的原理：

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培养基中唯一氮源是尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，利用尿素作为氮源进行繁殖。

㈡.统计菌落数目：

1、显微镜直接计数：

（1）方法：利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。

（2）缺点1）不能区分死菌与活菌；2）不适用于运动的、体积小的、浓度低的细菌；

2.间接计数法（活菌计数法）

⑴原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上形成的一个菌落是一个单细胞繁殖而成。

⑵常用方法：稀释涂布平板法。

每克样品中的菌落数＝(C÷V)×M

[C：平均菌落数，V：涂布时所用的稀释液的体积(ml)，M：稀释倍数] （3）注意事项

①选择一个培养皿中的菌落数在30——300的平板进行计数更准确。

②同一稀释度涂布到三个或三个以上的平皿中求平均数。

③统计的菌落数低于活菌的实际数，因一个菌落可能来源于多个细菌（稀释度较低时）。

④选择三种稀释度来涂布时，一般以第二个稀释度的平均菌落数在50个左右为最好。

㈢.设置对照：

1。目的：排除实验组中非测试因素对实验结果的干扰，提高实验结果的信度。

2。实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其原因。

（1）原因假设：1）土样不同，2）培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质) （2）实验方案：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照。

结果预测：如果结果与A同学一致，则证明与土样无关；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误。

小结：实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。

二。实验设计

（一）.原理：

尿素是一种重要的农业氮肥，只有转化成氨之后，才能被植物利用。尿素细菌能合成脲酶把尿素被分解成氨。

脲酶

CO(NH2)2+H2O

CO2+2NH3 （二）实验设计的内容：

包括实验方案、材料用具、实施步骤和时间安排等。

（三）实验流程：

土壤取样→样品系列稀释→涂布平板与培养→菌落计数→观察并记录结果

三.实验步骤

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1.土壤取样

（1）土壤微生物主要分布在距地表3～8cm的近中性土壤中，约70％～80％为细菌。

（2）从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去（铲已经过消毒处理）表层土3cm左右，再取样，将样品装入先前消毒过的信封中。

（3）在称取土壤和稀释土壤溶液的过程都应在火焰旁

2.制备培养基：

制备以尿素为唯一氮源的选择培养基为实验组，牛肉膏蛋白胨培养基作为对照组

。

3。样品的稀释：

（1）分离不同的微生物采用不同的稀释度，其原因是不同微生物在土壤中含量不同，其目的是保证获得菌落数在30～300之间。土壤中微生物含量高的稀释度就高

（2）一般选择3种稀释度：

细菌为104、105、106，

放线菌为103、104、105，

真菌为102、103、104。

4.微生物的培养与观察

（2）在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。

（1）培养不同微生物需要不同培养温度和时间。

细菌：30～37℃培养1～2d 放线菌：25～28℃培养5～7d 霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。

（3）同种微生物表现稳定的菌落特征，菌落的特征包括

形状、大小、隆起程度、颜色

等方面。

四、操作提示

1。无菌操作：

（1）小铁铲和信封要灭菌

（2）称量和稀释土壤、接种都要在火焰旁。

2。做好标记

：

（1）稀释用的试管要标记，按稀释度递增的顺序放在试管架上。

（2）使用的平板要注明培养基种类、培养日期、样品的稀释度

3。规划时间

：即完成每一步的时间要规划才有条不乱。

五.结果分析与评价

1.实验组只有一种菌落则选出了目的菌。

2。杂菌污染的判断：对照组有菌落、实验组中菌落特征有多种。

3. 某一稀释度的平板上有30—300个菌落，且同一稀释倍数的三个重复的菌落数差异较小，则实验成功，其平均值代表分解尿素的细菌数目。

4。同一稀释度的三个重复中菌落数差异较大，可能是培养基含其它氮源或没有做到无菌操作。

5。分解尿素细菌的鉴定：由于尿素分解产生氨，碱性增强，可用酚红指示剂来检测

PH变化（变红色）。

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【对点训练】

1．可以分离并鉴定出分解尿素的细菌的方法是(A

) A．以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂

B．以尿素为唯一氮源的培养基中加入二苯胺试剂

C．以尿素为唯一氮源的培养基中加入刚果红试剂

D．以尿素为唯一氮源的培养基中加入双缩脲试剂

2．选择培养基是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理、化学抗性而设计的培养基。利用这种培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。为选择酵母菌和硝化细菌，应选用的培养基分别为(

B

) A．伊红美蓝培养基、含青霉素的培养基

B．含青霉素的培养基、含氨的无机培养基

C．含氨的无机培养基、含青霉素的培养基

D．含青霉素的培养基、伊红美蓝培养基

3．下列有关微生物培养的叙述错误的是(

A

) A．在对微生物进行培养前，需要对微生物和培养基进行灭菌

B．分离能分解尿素的细菌，要以尿素为培养基中唯一的氮源

C．测定土壤样品中的细菌数目，常用稀释涂布平板法进行菌落计数

D．酵母菌发酵过程产生的酒精，对其他微生物生长有一定的抑制作用

4．某同学要分离土壤中能分解尿素的细菌，并统计每克土壤样品中的活菌数目，培养基配方如下表：

KH2PO4

Na2HPO4

MgSO4·7H2O 蛋白胨

1.4 g 2.1 g 0.2 g 1.0 g 葡萄糖

10.0 g 尿素

1.0 g 琼脂

15.0 g

(1)根据培养基的成分判断，该同学能否分离出土壤中分解尿素的细菌？______(能/不能)，原因是____________________________________________。

(2)该培养基为______培养基(按物理状态分)，因为培养基中含有______________。

(3)要统计每克土壤样品中活菌数目，宜采用____________________法。根据土壤样品的稀释倍数和接种稀释液的体积，统计平板上的________就能大约推测出样品中的活菌数。

(4)如果把该培养基中的蛋白胨去掉，培养基上的微生物是不是一定都是能分解尿素的细菌？________。为什么？__________________________________。

答案

(1)不能

培养基含蛋白胨，尿素不是唯一氮源，不能选择出只以尿素为氮源的微生物

(2)固体

凝固剂琼脂

(3)稀释涂布平板

菌落数目

(4)不一定

因为有些微生物可以利用尿素分解菌的含氮代谢产物进行生长繁殖

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