课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数教学设计方案

高二生物《选修一生物技术实践》学案（编号：N0.05）

班级: 小组名： 姓名: 课题

专题2微生物的培养与应用

№05 课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

主备

编制时间

使用时间

1．阐述选择培养基的应用原理；能根据各种微生物的代谢特征，配制选择培养基；

学习

2．阐述土壤中分解尿素的细菌的分离与计数过程，列举其中涉及的相关技术并会用这目标

些技术解决生产生活中的相关问题。

3．学会运用无菌技术完成微生物的分离、培养和技术各个环节。

学法学习本课题首先要理解微生物的特性，依据其特性创造条件对微生物进行选择培养同时指导

防止其他微生物的生长来达到分离的目的，因此必须熟读教材．．．．。

一、理论基础

1．筛选菌株

(1)实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于 生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时 或 其他微生物生长。 (2)选择培养基：在微生物学中，将允许 种类的微生物生长，同时 和 其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。

(3)配制选择培养基的依据

根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。例如，培养基中不加入有机物可以选择培养 微生物；培养基中不加入氮元素，可以选择培养 微生物；加入高浓度的食盐可选择培养金黄色葡萄球菌等。

(4)尿素只有被 分解成 之后，才能被植物吸收利用。

自

反应式表示为 主

2．统计菌落数目

探

（1）测定微生物数量的常用方法有 和 。

（2）稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目的原理

究

当样品的 足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个 。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在 的平板进行计数。

3．设置对照

设置对照的主要目的是排除实验组中 对实验结果的影响，提高实验结果的

。例如为了排除培养基是否被杂菌污染了，需以培养 的培养基作为空白对照。

二、实验设计（结合课题1学过的知识）

实验流程：土壤取样→样品的稀释→将稀释液涂布到以尿素为唯一氮源的培养基上→挑选能生长的菌落→鉴定。具体操作步骤如下：

1． 取样：从肥沃、湿润的土壤中取样。应先 3 cm左右，再取样。

2．制备 ：准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基

将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显 选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为 ，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。

3．微生物的 与观察

将10g土样加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中(体积为250 mL)，充分摇匀，吸取上清液 ，转移至盛有 的无菌水大试管中，将土样以1、101、102……

依次等比稀释至107稀释度，并按照由107～103稀释度的顺序分别吸取 进行平板涂布操作。每个稀释度下需要3个选择培养基、1个牛肉膏蛋白胨培养基。

将涂布好的培养皿放在30℃温度下培养，及时观察和记录。

挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含 的培养基的斜面中，观察能否产生如教材中图2-lO的颜色反应。

4．细菌的计数

当菌落数目稳定时，选取菌落数在 的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出 ，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。计算公式为 。

5．不同种类的微生物，往往需要不同的培养 和培养 。在实验过程中，一般每隔24小时统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果，这样可以 。

6．本课题中的无菌操作还须注意什么问题？

（1） （2） （3） 7．在进行多组实验过程中，应注意做好标记，其目的是 。

【思考1】分析下面培养基的配方：KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4·7H20、葡萄糖、尿素、琼脂。请回答：

(1)在该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别 生

和 。

(2)想一想这种培养基对微生物是否具有选择作用?如果具有，又是如何进行选择生

的? 共

探

【思考2】为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？

【思考3】用来判断选择培养基是否起到了选择作用需要设置的对照是什么？

师

【思考4】探究水中大肠杆菌数量的检测？

生

共

探

1

1．下列哪种成分是选择分解尿素的细菌的培养基的特有成分（ ）

A.葡萄糖 B.琼脂 C.尿素 D.脲酶

2.下列关于测定土壤中细菌数量的叙述，正确的是 ( ) A．一般选用103～107倍的稀液分别涂布

B．测定放线菌的数量，一般选用103、lO 4和105倍稀释

C．测定真菌的数量，一般选用103、104和105倍稀释

D．当第一次测量某种细菌的数量，可以将101～107倍的稀释液分别涂布到平板上培养

3.下列关于微生物的培养叙述错误的是( ) A．细菌一般在30～37℃的温度下培养1～2d B．放线菌一般在25～28℃的温度下培养5～7d C．霉菌一般在25～28℃的温度下培养3～4d D．不同种类的微生物，一般需要相同的培养温度和培养时间

4.下列可以鉴定出分解尿素的细菌的方法是 ( ) A．以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂

B．以尿素为唯一氮源的培养基中加入二苯胺试剂

C．以尿素为唯一氮源的培养基中加入苏丹Ⅲ试剂

基

D．以尿素为唯一氮源的培养基中加入双缩脲试剂

5.用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中础

得到以下几种统计结果，正确的是 ( )

A．涂布了一个平板，统计的菌落数是230 达

B．涂布了两个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238

C．涂布了三个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平均值163 标

D．涂布了三个平板，统计的菌落数分别是2l0、240和250，取平均值233 6．某同学为了调查水中细菌的污染情况而进行了实验。实验包括制备培养基、灭菌、接种及培养、菌落观察与计数。请回答于此实验有关的问题：

（1）培养基中含有的蛋白质、淀粉分别为细菌培养提供了 和 。除此之外，培养基还必须含有的基本成分是 和 。 （2）对培养基进行灭菌，应该采用的方法是 。

（3）为了尽快观察到细菌培养的实验结果，应将接种了湖水样品的平板置于 中培养，培养的温度设定在37℃，要使该实验所得结果可靠，还应该同时在另一平板上接种

作为空白对照进行实验。

（4）培养20小时后，观察到平板上有形态和颜色不同的菌落，这说明湖水样品中有 种细菌。一般来说，菌落总数越多，湖水遭受细菌污染的程度越 。

（5）如果提高培养基中NaCl的浓度，可以用于筛选耐 细菌，这种培养基被称为 。

7．在105稀释度下取1ml稀释液涂布平板，求出3个平板上菌落数的平均值是63，那么是多少?

【疑难点拨】

土壤中分解尿素的细菌的分离与计数：

1．分离菌株的思路

(1)自然界中目的菌株的筛选

①依据：根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。

②实例：PCR技术过程中用到的耐高温的Taq DNA聚合酶，就是从热泉中筛选出来的Taq细菌中提取出来的。

(2)实验室中目的菌株的筛选

①原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度.pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。

培养基选择分解尿素的微生物的原理：培养基的氮源为尿素，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源。缺乏脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长发育繁殖，而受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物

②方法：能合成脲酶的细菌才能分解尿素。配制以尿素为唯一氮源的培养基，能够生长的细菌就是能分解尿素的细菌。

2．统计菌落数目的方法

(1)稀释涂布平板法（间接）

①当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。

②通过统计平板上的菌落数来推测样品中大约含有的活菌数。

(2)利用显微镜直接计数

3．分解尿素的细菌的鉴定：细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，氨会使培养基的碱性增强。在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂培养细菌，若指示剂变红，可确定该种细菌能够分解尿素。

4．实验流程

土壤取样→样品的稀释→将稀释液涂布到以尿素为唯一氮源的培养基上→挑选能生长的菌落→鉴定



知识拓展：

1、Taq细菌是耐高温的微生物。

2、培养基对微生物具有选择作用。配置培养基时根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求，加入某些物质或除去某些营养物质，抑制其他微生物的生长，也可以根据某些微生物对一些物理、化学因素的抗性，在培养基中加入某种化学物质，从而筛选出待定的微生物。这种培养基叫做选择培养基。

3、测定微生物数量的方法：

①直接计数法：常用显微镜直接计数法，一般适用于纯培养悬浮液中各种单细胞菌体的计数。

②间接计数法：常用稀释平板计数法，平板培养基上长出一个菌落就代表原待测样品中一个微生物个体。4、通常用来作为菌种鉴定的重要依据的是菌落。

[参考答案] 1－5 CBDAD 6. （1）氮源 碳源 水 无机盐 （2）高压蒸汽灭菌法 （3）恒温培养箱 无菌水 （4）多 大 （5）盐 选择培养基

7．每克样品中的菌落数＝（C÷v）×M＝（63÷1）×105＝6.3×106

2

高二生物《选修一生物技术实践》学案（编号：N0.06）

班级: 小组名： 姓名: 课题

专题2微生物的培养与应用

№06 课题3分解纤维素的微生物的分离

主备

编制时间

使用时间

1．能简述纤维素酶的种类及作用；

学习

2．能从土壤中分离出分解纤维素的微生物；学会从土壤中分离某种特定微生物的原理目标

和操作技术。

3．知道分解纤维素的微生物的应用价值。

学法学习本课题首先要理解微生物的特性，依据其特性创造条件对微生物进行选择培养同时指导

防止其他微生物的生长来达到分离的目的，因此必须熟读教材．．．．。

一、基础知识

（一）纤维素与纤维素酶

1．纤维素的化学组成： 三种元素，是一种 糖。

2．纤维素的分布： 是自然界中纤维素含量最高的天然产物，此外，木材、作物秸秆等也富含纤维素。

3．纤维素酶的作用：纤维素酶是一种 ，一般认为它至少包括三种组分，即 酶、 酶 酶，前两种酶使纤维素分解成 ，第三种酶将纤维二糖分解成 。

（二）纤维素分解菌的筛选 1．筛选方法： 染色法。

2．筛选原理：刚果红可以与像纤维素这样的多糖物质形成 ，但并不自

和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应，当纤维素被纤维素酶分解后，红色复合物主

无法形成，出现以 为中心的透明圈，我们可以通过 来筛选纤维素分解菌。

探

二、试验设计

究

分离分解纤维素的微生物的实验流程图如下：

→

→梯度稀释→

→

1．土壤取样：采集土样时，应选择富含 的环境。 2．选择培养： （1）将滤纸埋入土壤目的：增加纤维素分解菌的 ，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物。

（2）)制备选择培养基：参照课本旁栏中的比例配制。

（3）选择培养：称取土样20g，在无菌条件下加入装有30mL培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在 上，在一定温度下振荡培养1～2d，直至培养液变 。也可重复选择培养。

（4）梯度稀释：依次将培养液稀释101～107倍。思考是如何操作的？

（5）将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上

（6）刚果红染色法：挑选产生 的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。

3．刚果红染色法：常用的刚果红染色法有两种

三、结果分析与评价

1．为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行 实验，纤维素酶的发酵方法有 发酵和 发酵。

2．纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的 含量进行定量测定。

【思考1】纤维素分解菌选择培养基属于 培养基，原因是什么？

【思考2】该培养基选择作用机制是什么？

生

生

【思考3】若设置一个对照实验说明选择培养的作用，应控制的变量是什么？

互

探

【思考4】本实验流程与尿素分解菌的分离实验流程有哪些异同？

【思考5】为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？

师

【思考6】用流程图表示分离培养微生物的一般方法

生

共

探

3

1．在加入刚果红的培养基中出现透明圈的菌落是 ( ) A．分解尿素的细菌 B．硝化细菌 C．分解纤维素的细菌 D．乳酸菌

2．关于选择培养叙述正确的是 ( ) A．可以增加纤维素分解菌的浓度 B．可以减少纤维素分解菌的浓度

C．所用培养基是固体培养基 D．所用培养基是平板培养基

3．刚果红染色时，加入刚果红可在 ( ) ①制备培养基时

②梯度稀释时 ③倒平板时 ④涂布时 ⑤培养基上长出菌落时

A．①③ B．②⑤ C．③⑤ D．①⑤

4．两种刚果红染色法的结果是（ ） A．均会出现透明圈

B．均不会出现透明圈

C．方法一出现方法二不出现 D．方法一不出现方法二出现

5．下列生物能分解纤维素的是（ ）

①人 ②兔 ③牛 ④蘑菇 ⑤纤维杆菌

A.①②③④⑤ B.②③⑤ C.②③④⑤ D.③⑤

6．在加入刚果红的纤维素培养基中出现透明圈的菌落是（ ）

基

A．分解尿素的细菌 B．硝化细菌 C．乳酸菌 D．分解纤维素的细菌

7．纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括 种组分，即 、 础

和 。

8．当纤维素被 分解后，刚果红一纤维素复合物就无法形成，培养基中达

会出现以 为中心的透明圈。这样，我们就可以通过是否产生

来筛选纤维素分解菌。

标

9.临床试用抗生素前，有时需要做细菌耐药实验。实验时，首先要从病人身上获取少量样本，然后按照一定的实验步骤操作，以确定某致病菌对不同抗生素的敏感性。回答下列问题：

（1）为了从样本中获取致病菌单菌落，可用 法或 法将样本接种于固体培养基表面，经过选择培养、鉴别等步骤获得。

（2）取该单菌落适当稀释，用 法接种于固体培养基表面，在37℃培养箱中培养24h，使其均匀生长，布满平板。

（3）为了检测该致病菌对于抗生素的敏感性，将分别含有A、B、C、D四种抗生素的滤纸片均匀置于该平板上的不同位置，培养一段时间后，含A的滤纸片周围出现透明圈，说明该致病菌对抗生素A ；含B的滤纸片周围没有出现透明圈，说明该致病菌对抗生素B__ ___；含C的滤纸片周围的透明圈比含A的小，说明_______ _ ；含D的滤纸片周围的透明圈也比含A的小，且透明圈中出现了一个菌落，在排除杂菌污染的情况下，此菌落很可能是抗生素D的 。

（4）根据上述实验结果，为达到抗菌目的，最好应选用抗生素 。



【疑难点拨】

1．分离分解纤维素的微生物的实验流程与稀释液的取样培养流程图有何异同？

它们的区别是：稀释液的取样流程图是筛选分解尿素的细菌是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为唯一氮源的选择性培养基上，直接分离得到菌落。分离分解纤维素的微生物的实验流程通过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，再将菌液涂布在选择培养基上。其他步骤基本相同。

2．将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋进土壤多深？

将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对聚集，实际上是人工设置纤维素分解菌的生存的适宜环境。一般应将纸埋于深约10cm左右腐殖土壤中。

3．为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？

在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。



分解纤维素的微生物的分离：

（1）实验原理：

①土壤中存在着大量纤维素分解菌，包括真菌、细菌和放线菌等，它们可以产生纤维素酶。纤维素酶是一种复合酶，可以把纤维素分解为纤维二糖，进一步分解为葡萄糖使微生物加以利用，故在用纤维素作为唯一碳源的培养基中，纤维素分解菌能够很好地生长，其他微生物则不能生长。

②在培养基中加入刚果红，可与培养基中的纤维素形成红色复合物，当纤维素被分解后，红色复合物不能形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，从而可筛选纤维素分解菌。

（2）实验过程：

土壤取样：采集土样时，应选择富含纤维素的环境

↓

选择培养：用选择培养基培养，以增加纤维素分解菌的浓度

↓

梯度稀释

↓

涂布平板：将样品涂布于含刚果红的鉴别纤维素分解菌的固体培养基上

挑选产生中心透明圈的菌落：产生纤维素酶的菌落周围出现透明圈，从产生明显的透明圈的菌落上挑取部分细菌，并接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在30～37℃条件下培养，可获得较纯的菌种。



刚果红染色的两种方法的比较：

先培养微生物，在加入刚果红

在到平板时加入刚果红

优显示出的眼神反映基本上是点

纤维素分解菌的作用

操作简便，不存在菌落混杂问题

(1)由于琼脂和土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶缺操作繁琐，加入刚果红溶液的微生物出现假阳性反应

点

会使菌落之间发生混杂

(2)有些微生物具有降解色素的能力，长时间培养会降解刚果红，从而形成明显的透明圈，这些微生物与纤维素分解菌不易区分

[参考答案] 1－6 CACACD 7.三 C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶 8. 纤维素酶 以纤维素分解菌 透明圈

9.（1）平板划线 稀释涂布平板

（2）涂布平板（3）敏感 不敏感 该致病菌对C的敏感性较A的弱 耐药菌 （4）A

4