课题3　血红蛋白的提取和分离第二课时教案

课题3 《血红蛋白的提取和分离》教学设计（第一课时）

一、教学目标

（一）知识与技能

1、尝试从血液中提取和分离血红蛋白

2、了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理

（二）过程与方法

体验血红蛋白提取和分离的实验的严格要求，注意按照操作提示进行相关步骤

（三）情感、态度与价值观

初步形成科学的思维方式，发展科学素养和人文精神

二、教学重点：（1）掌握血红蛋白提取和分离的基本过程和方法

（2）凝胶色谱法的原理和方法

三、教学难点：样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填

四、教学过程

（一）导入

1、在必修一我们已经学过蛋白质是生命活动的主要承担者。其中我们介绍了一种蛋白质——血红蛋白。它可以运输氧气和二氧化碳，是生命中不可缺少的物质。

我们一起回忆一下血红蛋白的结构特点：（ppt展示血红蛋白图片，老师引导学生用必须一必修二的知识分析血红蛋白的结构特点）。

提问：1.用猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？血液有哪些成分？

（二）凝胶色谱法的原理

学生看书讨论，小组合作学习。

①

如何分离生物大分子？基本思路是怎样的？

②

蛋白质分离和提取的原理是什么？

蛋白质各种特性的差异,如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等,可以用来提取和分离不同种类的蛋白质。

学生看书找到凝胶色谱法的定义，凝胶的成分是什么？凝胶颗粒本身有何特征？凝胶色谱法原理是什么？

(1)由多糖类化合物构成的凝胶,内部有许多贯穿的通道。

(2)当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时,相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道,路程较长,移动速度较慢,而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道,只能在凝胶外部移动,路程较短,移动速度较快,从而使相对分子质量不同的蛋白质分子得以分离。

分析下图，是学生对凝胶色谱法原理过程更清晰。

（三）缓冲溶液

引入：讲述运动员所穿的运动鞋，引导学生思考：缓冲溶液的缓冲作用体现在哪里？联系必修三知识请学生写出维持血液PH稳定的两对缓冲物质。以此分析缓冲溶液的概念和作用。

1.在一定的范围内，凡是能够抵制外界的酸或碱的影响使原来溶液PH值基本保持不变的混合溶液。

2.作用:在一定范围内,缓冲溶液能抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响,维持pH基本不变。

3.配制:由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成,通过调节缓冲剂的使用比例就可以得到在不同pH范围内使用的缓冲液。

思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是什么？目的是什么？

磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究（活性）。

（四）电泳

学生通过看书解决电泳的定义，电泳的方法，以及测定蛋白质分子常用的SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理。讲解电泳中凝胶和凝胶色谱法中凝胶的不同点，并强调SDS—聚丙烯酰胺凝胶的原理。

1.概念:指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。

2.原理:在一定的pH下,多肽、核酸等生物大分子的可解离基团会带上正电或负电,在电场的作用下,这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。

3.作用:电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异及分子本身的大小、形状的不同,使带电分子产生不同的迁移速度,从而实现样品中各种分子的分离。

4.类型:常用的电泳方法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。测定蛋白质相对分子质量时通常使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。

阅读书本了解相关知识：测定蛋白质相对分子质量通常用十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙烯酰胺凝胶电泳。

原理：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。SDS的作用：消除净电荷对迁移率的影响。

（五）实验操作

以学生为主体，探究、讨论模式结合：教师进行适当的引导，通过问题推进的办法提高学生质疑、假设、探究的能力。

1、蛋白质的提取和分离一般分为哪四个步骤？

样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定

2、视频展示蛋白质的样品处理以及初分离，引导学生理解

3、学生分小组的形式讨论学习，解决以下问题

①“红细胞洗涤”环节的目的是？采集的血样为什么要加入柠檬酸钠？

②洗涤时为什么用的是生理盐水而不是蒸馏水？为什么要强调多次洗涤？洗涤到什么情况才算干净？

③“分离血红蛋白溶液”步骤的原理是什么？离心后溶液分为4层，从上到下分别是何种物质？各有什么样的表观特征？如果高速离心后并未出现预期的分层现象，可能是什么原因？

④粗分离利用的是什么技术？主要的目的是什么？为什么透析袋外面用的是磷酸缓冲液？如果在透析袋外面的缓冲溶液中加入双缩脲试剂或出现什么现象？

基础知识

一般步骤：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。 1.样品处理：

(1)红细胞的洗涤: 反复加生理盐水并低速短时离心，去除上清液，直到上清液不呈现黄色为止。

目的: 去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化。

(2)血红蛋白的释放：

目的：在蒸馏水和甲苯作用下，使红细胞破裂释放血红蛋白。(蒸馏水是为了使红细胞吸水胀破；甲苯是为了溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放与分离。) (3)分离血红蛋白溶液：

①目的：经过离心使血红蛋白和其它杂质分离开来，便于下一步对血红蛋白的纯化

②试管中溶液层次：

搅拌好的混合液离心后明显分为4层（如下图），由上至下依次是甲苯层（无色透明）

、脂溶性物质的沉淀层（白色薄层固体）、血红蛋白的水溶液（红色透明液体）、红细胞破碎物沉淀（暗红色）。

③分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。

2、血红蛋白的粗分离----透析：

①原理：透析袋能使小分子自由进出，而大分子保留在袋内。

②目的：a一是除去样品中分子量较小的杂质。 b、二是使血红蛋白处于缓冲液环境中，便于后续的磷酸缓冲液在凝胶柱中进行洗脱。

五、课堂小结

总结本节课知识点及联系，强调本节课的重点和难点。