课题3　血红蛋白的提取和分离优质课教案推荐

5.3 血红蛋白的提取和分离 一、【课题目标】

（一）知识与技能

1、尝试从血液中提取和分离血红蛋白

2、了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理

（二）过程与方法

体验血红蛋白提取和分离的实验的严格要求，注意按照操作提示进行相关步骤

（三）情感、态度与价值观

初步形成科学的思维方式，发展科学素养和人文精神

二、【课题重点】

凝胶色谱法的原理和方法

三、【课题难点】

样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填

四、【教学方法】

启发式教学

五、【教学工具】

多媒体课件

六、【教学过程】

（一）设置问题，导入新课

1.用鸡的红细胞提取DNA，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？

2.血液有哪些成分？

（二）认真探究，掌握规律

1．基础知识

蛋白质的物化理性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，由此提取和分离各种蛋白质。

1．1凝胶色谱法（分配色谱法）：

（1）原理：（图5－13a）分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。

（3）分离过程：（图5－13b）

混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子

＊洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。

【动画演示凝胶色谱过程】

1．2缓冲溶液

（1）原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3－NaHCO3，HC－NaC，NaH2PO4/Na2HPO4等），调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。

（2）缓冲液作用：抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。

1．3电泳：

（1）原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。

（2）类型：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺经胶电泳等。

（3）分离过程：在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。

【思考】聚丙烯酰胺经胶电泳的原理、用途？

2．实验操作

2.1蛋白质的提取和分离一般分为哪些基本步骤？

样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定。

【思考】是否所有种类的蛋白质的提取和分离都是这样的？为什么？

不是。因为蛋白质的来源和性质不同，分离方法差别很大。

2.2从红细胞中分离出血红蛋白的过程为：洗涤红细胞、释放血红蛋白、分离血红蛋白、透析。洗涤红细胞的目的是什么？

除去血浆蛋白的杂蛋白，有利于后续步骤的分离纯化。

红细胞的洗涤过程为

血液＋柠檬酸钠→低速短时离心→吸出上层血浆→红细胞＋5倍体积生理盐水

→缓慢搅拌10min→低速短时离心→吸出上清液→反复洗涤直至上清液无黄色

【思考】加入柠檬酸钠有何目的？为什么要低速、短时离心？为什么要缓慢搅拌？

防止血液凝固；防止白细胞沉淀；防止红细胞破裂释放出血红蛋白。

【思考】你有什么方法将红细胞中的血红蛋白释放出来？

加入蒸馏水，用玻璃棒快速搅拌一段时间。

补充：加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。加入甲苯的目的是溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放和分离。此时，红细胞破碎混合液中不仅含有血红蛋白，而且还含有细胞破碎物、脂质、甲苯有机溶剂等。怎样除去这些杂质呢？由于它们的密度不同，科学家采取了离心分离的方法：

红细胞破碎混合液→中速长时离心（2000c/min×10min）→滤纸过滤除去脂质→分液漏斗分离出血红蛋白

2.3如何除无机盐离子和小分子有机物质呢？。

透析。半透膜的选择透过性，大分子物质不能通过半透膜，离子和小分子能够通过半透膜。

在透析过程中，血红蛋白溶液中的离子和小分子不断通过半透膜扩散进入到pH＝7的磷酸缓冲液中。

【思考】为何使用pH＝7的磷酸缓冲液？为什么缓冲液量远多于血红蛋白溶液量？

（三）迁移应用，深化知识

例1 利用凝胶色谱法，什么样的蛋白质先洗脱出来（ ）

A. 相对分子质量大的

B. 溶解度高的

C. 相对分子量小的

D. 所代电荷多的

解析：凝集色谱法使根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。相对分子质量较小的蛋白质能进入凝胶内部通道，路程较长，移动速度较慢；相对分子质量大的蛋白质，路程较短，移动速度较快，首先洗脱出来。

答案：A 例2 蛋白质提取和分离分为哪几步（ ）

A. 样品处理、凝胶色谱操作、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳

B. 样品处理、凝胶色谱操作、纯化

C. 样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定

D. 样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定

解析：蛋白质的提取和分离分为样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定四步。A中凝胶色谱操作及SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳为实验操作过程中的技术 答案：C 例3用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质（ ）

A路程较长，移动速度较慢 B路程较长，移动速度较快

C路程较短，移动速度较慢 D路程较短，移动速度较快

解析：在小球体内部有许多贯穿的通道，当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。 答案：D 【教学体会】

本课题重在让学生了解生物科学在蛋白质领域的进展，说明提取、分离高纯度的蛋白质的重要性和必要性，并学习一些蛋白质分离和提取的基本技术。教师可以发挥学生的主动性，让学生介绍当前有关蛋白质研究的新进展，激发学生的学习兴趣，然后指出本课题的学习意义，让学生初步体会分离纯化蛋白质的过程和方法。