课题3　血红蛋白的提取和分离优秀导入

《血红蛋白的提取和分离》教案

《血红蛋白的提取和分离》是人教版选修一模块《生物技术实践》

中的实验内容，其目的是使学生体验从复杂细胞混合物体系中提取生物

大分子的基本原理、过程和方法，该实验虽然操作难度较大，但原理清

晰，动手机会较多，是2019年新增的高考内容,因此，学生有一定的学

习兴趣。

【教学目标】

1、尝试从血液中提取和分离血红蛋白

2、了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理

【教学重点】

凝胶色谱法的原理和方法

【教学难点】

样品的预处理;色谱柱填料的处理和色谱柱的装填

【教学准备】 血红蛋白的提取和分离PPT 【教学课时】 共三课时〔其中讲解练习一课时〕

【教学过程】 第二课时

(一)引入新课

蛋白质是生命活动的主要承担者，是细胞内含量最高的有机化合物。

对蛋白质的研究有助于人们对生命过程的认识和理解。所以需要从细胞

中提取蛋白质进行研究。怎样分离纯化已提取的粗蛋白质呢?

(二)【粗分离】凝胶色谱法

蛋白质的物化理性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、

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吸附性质、亲和力等千差万别，由此分离纯化各种蛋白质。

(1)

原理：(见课件图) 分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快;分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。

(2)凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。

(3)分离过程：

混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子

洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。

缓冲液作用：抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。

凝胶色谱分离蛋白质包括：制作色谱柱、装填色谱柱、样品加入和洗脱。

根据教材图5-19，说出制作色谱柱需要的材料。

橡皮塞2个、打孔器、小刀、移液管、尼龙纱、尼龙网、玻璃管、尼龙管等。

色谱柱的制作过程：准备材料→加工橡皮塞→安装色谱柱

(三)

下面进行第二步凝胶色谱柱的装填。

请阅读教材：色谱柱的装填过程。

1、凝胶色谱柱的制作

取长100cm，内直径1.6cm的玻璃管，两端需用砂纸磨平。底塞打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，导致蛋白质分离不彻底。

2、凝胶色谱柱的装填

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计算并称取一定量的交联葡聚糖凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。将色谱柱装置固定在支架上，将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，凝胶沉集后，将溶剂放出至胶面不再下降，并且通过2～3倍柱床体积的溶剂(20mmol/L的磷酸缓冲液，pH 7.0)使柱床稳定。装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300 mL的20mmol/L的磷酸缓冲液(pH为7.0)充分洗涤平衡12h。注意事项：凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙;装填凝胶柱时不得有气泡存在，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果;液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动，从而影响生物大分子物质的分离效果;注意不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。

3、样品加入和洗脱。其基本过程是：

调节缓冲液面→加入蛋白质样品→调节缓冲液面→洗脱→收集分装蛋白质

至此，血红蛋白即可得到粗分离。在整个操作过程中，应当注意以下事项：纯化：可采用柱型为Sephadex G75，柱体积为500 mL的色谱柱;加样量为10 mL(约含蛋白200 m g);用20mmol/L的磷酸盐缓冲液(pH为7.0)进行洗脱，洗脱速度可控制为0.5 mL /min，即20 min /管。此时可用A280的紫外线进行检测，如果测得的数值很高，说明蛋白含量过高，此时需要进行稀释。下图是将每管取0.5 mL稀释10倍后，用紫外线测量的结果(如下图)。

由图中数值可知，33-38管对应的数值为血红蛋白的吸收值，选择此时的试管进行蛋白质纯度的鉴定是比较合适的。

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4.实验操作步骤及注意事项

本课题的主要目的是运用凝胶色谱法对蛋白质进行分离纯化，

脱色的目的是脱去背景颜色以体现出蛋白条带。一般来说，条带分明，目的条带清晰，无扩散，前沿比较直，说明实验结果比较好，样品比较纯。

(四)教学体会

本课题的实验操作相对复杂，影响实验效果的关键环节之一是凝胶色谱柱的制作和装填，对实验者的操作有很高的要求，建议有条件的学校直接购买商品色谱柱。由于甲苯是剧毒试剂,不太适合在中学实验中使用，因此，我们尝试在血红蛋白的释放时，只使用蒸馏水使细胞涨破,也获得了很好的实验效果。电泳过程中制胶、染色和脱色耗时较多，建议由教师完成，其他环节由师生共同完成。此外，本课题也可选用鸡血或猪血作为实验材料。

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