课题3　血红蛋白的提取和分离优质课教案推荐

专题5

DNA与蛋白质技术

课题5.3

血红蛋白的提取和分离

四川省南充市李渡中学

曾语潇

一、【课题目标】

知识与能力目标

1、尝试从血液中提取和分离血红蛋白。

2、说出色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。

学科素养

1、基础知识（从血液中提取和分离血红蛋白；色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理）；

2、基本技能（通过体验血红蛋白提取和分离的实验的严格要求，注意按照操作提示进行相关步骤，培养学生理论联系实际的能力）；

3、基本思想（通过体验血红蛋白提取和分离的实验的严格要求，初步形成科学的思维方式，发展科学素养和人文精神）；

4、基本活动经验（通过色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理的学习，关注学生科学态度的教育，拓展学生视野）。

二、【课题重点】

凝胶色谱法的原理和方法

三、【课题难点】

样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填

四、【教学方法】

启发式教学

五、【教学工具】

多媒体课件

六、【教学过程】（共2课时）

（一）引入新课

回顾蛋白质的相关知识

知识回顾--------有关蛋白质的几个问题：

1、含量：占细胞干重的50％以上，细胞中含量最多的有机物

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2、组成元素：主要是C、H、O、N

3、相对分子质量：高分子化合物

4、基本组成单位：氨基酸

结构简式

种类：20种

H

C

NHCOOH

R

5、氨基酸连接方式：脱水缩合

蛋白质是生命活动的主要承担者，是细胞内含量最高的有机化合物。对蛋白质的研究有助于人们对生命过程的认识和理解。所以需要从细胞中提取蛋白质进行研究。怎样提取蛋白质呢？

（二）进行新课

1．基础知识

a.分离生物大分子的基本思路

选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子

b.蛋白质分离和提取的原理

根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。

c.高温灭菌和酒精灭菌的结果

使微生物的蛋白质发生变性、蛋白质的空间结构被破坏。

1.1凝胶色谱法（分配色谱法）：

1.1.1凝胶：一些微小多孔的球体（内含许多贯穿的通道，大多数由多糖类化合物构成，如葡聚糖、琼脂糖。）

1.1.2概念：根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法

1.1.3原理：（分子筛效应）（图5－13a）

当不同的蛋白质通过凝胶时

相对分子质量较小

相对分子质量较大

容易进入

无法进入凝胶内部的通道

凝胶内部的通道

只能在凝胶外部移动

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路程较长移动速度较慢

路程较短移动速度较快

相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离

1.1.4分离过程：（图5－13b）通过动画演示

混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子

＊洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。

1.2缓冲溶液

1.2.1概念：在一定的范围内，凡是能够抵制外界的酸或碱的影响，使原来溶液pH值基本保持不变的混合溶液。

1.2.2缓冲液的组成举例：H2CO3

—

NaHCO3

CH3COOH —

CH3COONa NaH2PO4 —

Na2HPO4 1.2.3缓冲溶液的配制：

通常由（1-2）种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的（使用比例）就可以制得（在不同PH范围内）使用的缓冲液。

1.2.4思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？

使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和材料的科学研究（活性）。

1.3凝胶电泳法：

1.3.1概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程（在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动）

1.3.2原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。

［思考］阅读教材后，填写下表：

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1.3.3类型：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。

1.3.4实例：SDS—聚丙稀酰胺凝胶电泳

SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。使电泳迁移率完全取决于分子的大小。

2.实验操作

2.1蛋白质的提取和分离步骤

样品处理

粗分离

纯化

纯度鉴定

思考：是否所有种类的蛋白质的提取和分离都是这样的？为什么？

不是。因为蛋白质的来源和性质不同，分离方法差别很大。

2.2样品处理及粗分离

A.思考：人们用鸡的红细胞提取DNA，用猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？

鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取；哺乳动物成熟的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。

B.

血液有哪些成分？

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C.血红蛋白的特点

2.2.1红细胞的洗涤

a.洗涤红细胞的目的是什么？

去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化，洗涤次数不可过少。

红细胞的洗涤过程为

血液＋柠檬酸钠→低速短时离心→吸出上层血浆→红细胞＋5倍体积生理盐水→缓慢搅拌10min→低速短时离心→吸出上清液→反复洗涤直至上清液无黄色

思考：加入柠檬酸钠有何目的？为什么要低速、短时离心？为什么要缓慢搅拌？

防止血液凝固；防止白细胞沉淀；防止红细胞破裂释放出血红蛋白。

思考：洗涤红细胞时能不能用蒸馏水代替生理盐水？为什么？

生理盐水能保持红细胞的渗透压稳定而不至于破裂。在未洗净血浆中的杂质蛋白前，红细胞如果提前破裂，就可能使血红蛋白与杂质血浆蛋白混在一起，加大了分离的难度。

2.2.2血红蛋白的释放

在蒸馏水和甲苯的作用下，红细胞破裂释放血红蛋白

思考：在血红蛋白释放过程中，加入蒸馏水和甲苯的目的是什么？

提示：(1)加入蒸馏水使红细胞吸水涨破。

(2)细胞膜的主要成分为磷脂，易溶于甲苯等有机溶剂，加入甲苯能加速红细胞破裂并释放出血红蛋白。

2.2.3分离血红蛋白溶液

红细胞破碎混合液中不仅含有血红蛋白，而且还含有细胞破碎物、脂质、甲苯有机溶剂等。怎样除去这些杂质呢？由于它们的密度不同，科学家采取了离心分离的方法：

红细胞破碎混合液→中速长时离心（2000r/min×10min）→滤纸过滤除去脂质→分液漏斗分离出血红蛋白。

2.2.4透析（粗分离）

如何除无机盐离子和小分子有机物质呢？

透析。半透膜的选择透过性，大分子物质不能通过半透膜，离子和小分子能够通过半透膜。

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a.

过程：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时。

（通过动画演示透析过程）

b.透析目的：除去样品中分子量较小的杂质，或用于更换样品的缓冲液。

思考：为何使用pH＝7的磷酸缓冲液？为什么缓冲液量远多于血红蛋白溶液量？

维持血红蛋白的正常特性。有利于杂质分子充分地向外扩散。

小结：样品处理及粗分离

1、红细胞的洗涤

目的是去除杂蛋白。要加入柠檬酸钠防止血液凝固；离心将血液分层，用胶头吸管吸出黄色血浆；用生理盐水重复洗涤三次。

2、血红蛋白的释放

在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放血红蛋白。

3、分离血红蛋白溶液

高速离心分层；滤纸过滤去除脂溶性沉淀层；分液漏斗分出下面的红色透明液体。

4、透析（粗分离）

装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（PH为7.0）透析。

2.3凝胶色谱操作

通过以上四个基本过程，红细胞中的血红蛋白就被提取出来。但其中还含有其他种类的蛋白质分子（如呼吸酶等）。怎样将杂蛋白与血红蛋白分离开来呢？我们来研究蛋白质提取和分离的第二个步骤――粗分离（凝胶色谱操作）。

2.3.1凝胶色谱柱的制作（图5-19）

①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平

②底塞的制作

打孔

挖出凹穴

安装移液管头部

覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端

注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。

③顶塞的制作：打孔

安装玻璃管

④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体

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⑤安装其他附属结构

2.3.2凝胶色谱柱的装填

①凝胶的选择

②凝胶的使用前处理

③凝胶色谱柱的装填方法

注意：1.凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。

2.装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。

④洗涤平衡

注意：1.液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。

2．不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象

2.3.3.样品的加入与洗脱

①调节缓冲液面

②滴加透析样品（图5-22）

注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。

2、贴壁加样。

3、使吸管管口沿管壁环绕移动

③样品渗入凝胶床

④洗脱

⑤收集

2.4SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳——鉴定血红蛋白纯度

小结：

蛋白质的提取和分离一般分为四步：

（1）样品处理

包括洗涤红细胞；血红蛋白的释放；离心等操作分离血红蛋白溶液。

（2）粗分离

透析除去分子较小的杂质。

（3）纯化

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通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。

（4）纯度鉴定

通过SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。

3操作提示

3.1.

红细胞的洗涤：

洗涤次数不能过少；低速、短时离心。

3.2.

凝胶的预处理：

沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡

3.3.

色谱柱的装填：装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。

3.4.

色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。

思考下面的问题

1、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？

答：让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能。

2、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质得分离有什么意义？

答：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。

4结果分析与评价

4.1你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？

观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。

4.2你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你

的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？

由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖—2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。

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4.3

你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？

如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）

5.实践训练

6.教科书问题解答

七、【教学体会】

本课题重在让学生了解生物科学在蛋白质领域的进展，说明提取、分离高纯度的蛋白质的重要性和必要性，并学习一些蛋白质分离和提取的基本技术。教师可以发挥学生的主动性，让学生介绍当前有关蛋白质研究的新进展，激发学生的学习兴趣，然后指出本课题的学习意义，让学生初步体会分离纯化蛋白质的过程和方法。

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