课题2　多聚酶链式反应扩增DNA片段教学设计及教案分析

对高中生物课本中PCR技术的几点思考

选修3——《现代生物科技专题》中介绍了用PCR技术扩增目的基因。在实际的教学过程中遇到好几个问题，现将本人对这些问题的思考介绍如下：

一、为何不需要解旋酶？

DNA解旋酶能降低DNA双链解成单链的活化能，在解旋酶的催化作用下，由ATP提供能量,在生物体内的温和条件下就能使DNA的双链解成单链。在没有酶的催化作用下，就必须由外界提供更多的能量才能使DNA分子活化，当在体外加热到90oC—95 oC，DNA分子就由常态转化为活跃状态，双链则解成单链。所以PCR技术扩增目的基因不需要解旋酶。

二、为什么加入的原料是dNTP（脱氧核苷酸三磷酸）,而不是四种脱氧核苷酸？

同学们在学习DNA复制的时候，都掌握了DNA的复制需要四种脱氧核糖核苷酸作为原料，而PCR技术扩增目的基因需要的原料却是dNTP（脱氧核苷酸三磷酸）。同学们都有这样的疑问：同样是DNA的复制二者所需要的原料为何会不同呢？事实上在DNA复制时直接参与合成DNA的是四种脱氧核苷酸三磷酸（dATP、dGTP、dCTP、dTTP），在 DNA聚合酶催化作用下，引物或者已合成的DNA链的3’—羟基对进入的脱氧核苷酸三磷酸α—磷原子发生亲核攻击，从而形成3’，5’—磷酸二酯键并脱下焦磷酸（PPi）。形成磷酸二酯键所需要的能量来自α—与β—磷酸基之间高能磷酸键的裂解。（摘于沈同、一镜岩主编的第二版《生物化学》下册P328）。而在生物体内脱氧核苷酸在磷酸激酶的催化下接受 ATP提供的磷酸基，逐步转化为脱氧核苷酸二磷酸、脱氧核苷酸三磷酸后再参与DNA的合成。所以二者并不矛盾，用dNTP作原料在体外利用PCR技术扩增目基因简化了操作过程。

三、为什么没有加入ATP？

DNA的体内复制需要ATP作为能量物质，而体外利用PCR扩增目的基因为何没加入ATP呢？因为体内DNA的复制过程中，解旋酶将DNA双链解成单链、脱氧核苷酸之间磷酸二酯键的形成需要ATP提供能量。而体外DNA的扩增不需要解旋酶的催化，是通过提高温度使双链解成单链，这一步不需要ATP提供能量；由问题二可知形成磷酸二酯键所需要的能量来自α—与β—磷酸基之间高能磷酸键的裂解（在体内是脱氧核苷酸在磷酸激酶的催化下接受 ATP提供的磷酸基转化为脱氧核苷酸三磷酸时，将ATP内高能磷酸键的能量转移到脱氧核苷酸三磷酸分子内）。所以体外PCR扩增目的基因不需加入ATP。

四、延伸过程是否需要DNA连接酶？ 现行的一些相应配套习题关于PCR扩增目的基因是否需要DNA连接酶说法不一，本人查阅到体内DNA的复制是边解旋边复制，且是半不连续复制，DNA分子的两条链是反向平行的，一条链的走向为5’－3’，另一条链为3’—5’，而DNA聚合酶的合成方向都是5’—3’，所以在3’—5’走向的模板链上能以5’—3’方向连续合成，称为前导链，另一条5’—3’走向的模板链上随复制叉的移动，形成许多5’—3’方向的不连续片段（称为冈崎片段），在DNA连接酶的作用下连接成一条完整的DNA链，称为滞后链。PCR扩增的原理是DNA双链复制的原理，但过程却不同于体内复制过程，既不是边解旋边复制，也不是半不连续复制，是DNA双链全部解成单链后，引物与DNA单链相应序列互补结合，然后在DNA聚合酶作用下同时以5’—3’方向连续合成进行延伸，不存在前导链与滞后链的区别，自然也就不需要DNA连接酶了。

五、引物的作用是什么？

在学习过程中学生问到这样的问题：必修课本DNA复制那一节并未介绍DNA的复制需要引物，而利用PCR 扩增目的基因的时候则需要引物，那加入引物有何作用呢？实际上DNA

的复制都需要引物，在体内复制时，先由RNA聚合酶在DNA的模板上合成一段RNA引物，再由DNA聚合酶从RNA3’端开始合成新的DNA链，高中阶段为便于学生理解DNA的复制就没有介绍这部分知识，体外复制当然也要加引物了。但PCR技术扩增目的基因进加入引物还有特殊的作用。PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5’端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3’端开始延伸，其5’端是固定的，3’端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的5’端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3’端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用（见下图示）。由以上分析可知引物决定了扩增基因的特异性。

靶DNA的扩增

5’

3’

(a)

5’

3’

第一

5’

3’

次

引物2 循(b) 引物1 环5’

3’

产生

长引物2互补链

段产(c) 5’

3’

物

片段

长产物片段

5’

3’

引物1互补链

(d) 3’

5’

第

二长产物片段

新引物

次

5’

3’

循

环产

(e) 生3’

5’

短5’

3’

短产物片段

产3’

5’

物

3’

5’

片

段

3’

5’

(f)

新引物

短

3’

5’

片段

的

指5’

3’

数(g) 5’

3’

增长

5’

3’

3’

5’

六、一定要知道目的基因的全部核苷酸序列吗？

课本谈到利用PCR技术扩增目的基因的前提，是要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便合成引物。有部分同学错误理解为PCR技术扩增目的基因要知道目的基因的全部核苷酸序列，由问题五可知PCR技术扩增的是两引物结合位点之间的序列。引物的设计直接影响到其扩增的特异性。所以只需要知道合成引物的脱氧核苷酸序列就行了，没有必要知道目的基因的全部序列。

七、PCR扩增为何要设为3段温度（90C—95C、55C—60C 、70C—75C），而不设为2段温度（90C—95C、70C—75C）？学生在学习这一部分知识时提出，温度降到55C—60C退火是为了使引物与单链DNA模板通过碱基互补配对形成氢键，在70C—75C下进行子链的合成延伸时仍在形成氢链，为何退火与延伸不在同一温度下进行呢？适宜温度下退火能减少非特异性结合，保证引物同目的序列有效结合。退火温度一般设定比引物的Tm(当50％的引物和互补序列表现为双链分子时的温度)低5C—10C。Tm值大小主要与GC含量有关，GC含量越高，Tm值越大，计算公式为Tm=4（G+C）+2（A+T）,各种引物因为长短、GC含量等不同，退火温度一般为25℃-65℃不等。而Taq酶在72℃左右才有最佳的活性。因此退火温度与延伸温度相差较大，所以要分为3段温度进行。

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