课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数教学实录

土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与

计数

★课题目标

(一)知识与技能

利用选择培养基分离细菌，运用相关技术解决生产生活中有关微生物的计数

(二)过程与方法

分析研究思路的形成过程，找出共性和差异性

(三)情感、态度与价值观

形成无菌不在的概念，养成讲究卫生的习惯

★课题重点

对上样的选取和选养基的配制

★课题难点

对分解尿素的的

★教学方法

后发式教

一、研究思路（阅读教材P21～23）

1．筛选菌株

微生物筛选的原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长，该类培养基是选择培养基。

2．统计菌落数目

(1)统计菌落数目的常用方法：稀释涂布平板法。

(2)统计依据：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，能推测出样品中大约含多少活菌。

3．设置对照：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

二、实验设计（阅读教材P23～24）

操作步骤：土壤取样→样品的稀释→微生物的培养与观察。

1．土壤取样一般要铲去表层土，因为绝大多数细菌分布于距地表约

3～8_cm的土壤层。

2．样品的稀释：不同的微生物需要稀释的倍数不同，请填写下表

微生物

稀释倍数

细菌

104、105、106

放线菌

103、104、105

真菌

102、103、104

3.微生物的培养与观察

微生物的生长受温度的影响，菌落的数目和特征是观察的主要内容。

三、操作提示（阅读教材P25～26）

1．无菌操作：取土样用的小铁铲和盛土样的信封都要进行灭菌。称取土样要在火焰旁进行。稀释样品要在火焰旁操作。

2．做标记：对平板和试管进行标记，尤其进行系列稀释时要按照稀释度递增的顺序将试管排列成行。

四、课题延伸（阅读教材P26）

1．分解尿素的细菌合成的脲酶将尿素分解成氨，使培养基的碱性增强。

2．在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂培养细菌，若指示剂变红，可确定

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该种细菌能够分解尿素。

[共研探究] 1．自然界中目的菌株的筛选

如图是美国黄石国家公园的一个热泉，从耐热细菌中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶。

(1)实例：DNA多聚酶链式反应(PCR)是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温(93 ℃左右)的DNA聚合酶。

(2)Taq细菌能从热泉中被筛选出来的原因：热泉温度70～80 ℃，淘汰了绝大多数微生物，而使耐热的Taq细菌被筛选出来。

(3)自然界中目的菌株的筛选依据：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。

2．实验室中目的菌株的筛选

(1)原理：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。

(2)方法：利用选择培养基分离。

(3)选择培养基

①概念：允许特定种类的微生物生长，同时阻止或抑制其他种类微生物生长的培养基。

②下面是本课题使用的培养基的配方，请分析：

KH2PO4

Na2HPO4

MgSO4·7H2O 葡萄糖

尿素

琼脂

将上述物质溶解后，用蒸

馏水定容到1 000 mL 1.4 g

2.1 g 0.2 g 10.0 g 1.0 g 15.0 g

a.由于加入了凝固剂琼脂，从物理性质看此培养基属于固体培养基，从功能上看属于选择培养基。

b．在该培养基的配方中，碳源是葡萄糖，氮源是尿素。

c．绝大多数微生物都能利用葡萄糖，只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素。以尿素为唯一氮源的培养基可以分离得到产生脲酶的微生物(即分解尿素的微生物)。

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3．统计菌落数目

常用来统计样品中活菌数目的方法是稀释涂布平板法。

(1)统计菌落数目

①稀释：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。

②计数：一般选择菌落数在

30～300的平板进行计数。

③统计：通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为使结果接近真实值，可将同一稀释度加到三个或三个以上的平板中，经涂布，培养计算出菌落平均数。

(2)活菌数的计算方法(公式)：每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M，C表示：某一稀释度下平板上生长的平均菌落数；V表示：涂布平板时所用的稀释液的体积；M表示稀释倍数。

4．设置对照

(1)设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

(2)设置对照的方法：①空白对照：不给对照组任何处理因素；②条件对照：给对照组施以部分实验因素，但不是所要研究的处理因素；③自身对照：对照组和实验组都在同一研究对象上进行；④相互对照：不单设对照组，而是几个实验组相互对照。

(3)教材P22～23提供的案例中A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。一是由于土样不同，二是由于培养基污染或操作失误。如何设置对照实验来确定原因？

提示：方案一：其他同学用与A同学一样的土样进行实验，如果结果与A同学一致，则证明A同学操作无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。

方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。

【拓展】

显微镜直接计数也是测定微生物数量的常用方法

(1)原理：此法利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量，但不能区分细菌的死活。计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的底面积为1 mm2高为0.1 mm的计数室，1 mm2的底面积又被划分成25个(或16个)中格，每个中格进一步划分成16个(或25个)小格，计数室由400个小格组成。

(2)操作：盖上盖玻片，将稀释的样品滴在计数板上，然后在显微镜下计数4～5个中格中的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按公式求出每毫升样品中所含的细菌数。

(3)计数公式：每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10 000×稀释倍数。

(4)缺点：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察。

[总结升华] 1．选择培养基

(1)选择培养基的含义：在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进需要的微生物的生长。目的是从众多微生物中分离出所需要的微生物。

(2)常见的选择培养基

①加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。

②加入高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌。

③无氮源培养基可以分离固氮微生物。

④以石油为唯一碳源的培养基，可以分离能消除石油污染的微生物。

⑤将培养基放在高温环境中培养，分离耐高温的微生物。

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2．用稀释涂布平板法对微生物进行计数时的注意事项

(1)为了保证结果准确，一般设置3～5个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取其平均值。

(2)统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。

[对点演练] 1．要从多种细菌中分离某种细菌，培养基要用(

) A．加入青霉素的培养基

B．固体培养基

C．液体培养基

D．加入高浓度食盐的培养基

解析：选B

将聚集的菌种逐步稀释分散到固体培养基的表面，经过培养，可以分离到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的一定形态的菌落，即分离出某种细菌。

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