课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数优质课教案内容

课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

一、教学目标

1.知识与技能

利用选择培养基分离细菌，运用相关技术解决生产生活中有关微生物的计数

2.过程与方法

分析研究思路的形成过程，找出共性和差异性

3.情感、态度与价值观

形成无菌不在的概念，养成讲究卫生的习惯

二、教学重点

对土样的选取和选择培养基的配制

三、课题难点

对分解尿素的细菌的计数

四、教学方法

启发式教学

五、教学内容

（一）温故知新

1.培养基的类型？营养及要求？配制过程？

2.消毒与灭菌的区别？方法？

3.纯化大肠杆菌所用的培养基？两个阶段？

4.最常用的接种方法？菌种保藏方法？

5.检测亚硝酸盐的原理、试剂

6.制果酒、果醋、腐乳、泡菜的菌种名称、代谢类型、生殖方式、发酵温度及时间

（二）课题背景

1、尿素的利用

尿素是一种重要的农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中的细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。

2、细菌能利用尿素的原因

土壤中的细菌分解尿素是因为它们能合成脲酶

（三）课题教学

1.研究思路

(1)筛选菌种

A.实例：寻找耐高温的DNA聚合酶

PCR技术：要求使用耐高温（930C）的DNA聚合酶。

生存环境的要求：

寻找耐高温的酶，寻找耐高温生物体，耐高温环境（热泉、火山口）？

启示：

寻找目的菌种时要根据它对_______________，到相应的环境中去寻找。

筛选原因:

因为热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物，使耐热的Taq细菌保留下来。

B.实验室中微生物的筛选原理

人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物生长。

思考：

1.该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？

氮源：尿素 碳源：葡萄糖、尿素

2.此配方能否筛选出产生脲酶的细菌？为什么？

原则上能。只有产生脲酶的细菌能利用尿素作为氮源而生存。

3

选择培养基：

特定种类的微生物生长

在微生物学中，将允许______________________，同时_________________________生长的培养基。

结果：培养一定时间后，该菌数量上升，再通过稀释涂布平板等方法对它进行纯化培养分离。

举一反三

（1）将土壤中的固氮菌分离出来

（2）将土壤中自养微生物分离出来

（3）筛选出抗青霉素的微生物

（4）筛选出耐高浓度食盐的微生物

……

2.如何对细菌进行计数？

(1)显微镜直接计数：

利用血球计数板(血细胞计数板），在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。

此法的缺点是不能区分死菌和活菌。统计数目比实际数目高

显微镜直接计数法：这种方法是利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。

此法的缺点是不能区分死菌和活菌。

(2)

稀释涂布平板法（间接计数）

(2)统计菌落数目

方法:

运用稀释涂布平板法来统计样品中的活菌数。

原理: 1个菌落←1个活菌

注意事项

①选择菌落数在30～300的平板上计数。

②需培养计算出三个或三个以上的平板菌落求平均数。

③统计的菌落往往比活菌的实际数目低。

除上述两种常用的计数方法外，还有膜过滤法、比浊法。膜过滤法是当样品中菌数很低时，可以将一定体积的湖水、海水或饮用水等样品通过膜过滤器。然后将滤膜干燥、染色，并经处理使膜透明，再在显微镜下计算膜上(或一定面积中)的细菌数；

比浊法原理是在一定范围内，菌的悬液中细胞浓度与混浊度成正比，即与光密度成正比，菌越多，光密度越大。因此可以借助于分光光度计，在一定波长下，测定菌悬液的光密度，以光密度表示菌量。实验测量时一定要控制在菌浓度与光密度成正比的线性范围内，否则不准确。微生物计数法，发展迅速，现有多种多样的快速、简易、自动化的仪器和装置等方法。

计算公式：

某同学在稀释倍数为106 的培养基中测得平板上菌落数的平均数为234，那么每克样品中的菌落数是（涂布平板时所用稀释液的体积为0.1ml） ( ) A. 2.34×108 B. 2.34×109 C. 234 D. 23.4

(3)设置对照实验

设置对照的目的：

排除实验组中非测试因素对试验结果的影响，提高实验结果的可信度。

阅读P22～23页“（三）设置对照”一段讨论教材中提出的问题。

(1)A同学出现此结果的可能原因？

⑴土样不同

⑵培养基污染

(或混入了其他的含氮物质)

(3)设置对照实验，帮助A同学排除上述两个可能影响实验结果的因素？

方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验

A无误

结果预测：如果结果与A同学一致，则证明______；如果结果不同，则证明A同学存在____________________________培养基的配制有问题。

方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。

这个实例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少

主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。判断培养基中是否有杂菌污染：

将未接种的培养基同时进行培养。（空白对照）

判断选择培养基是否具有筛选作用完全培养基（营养成分齐全）接种后培养做对照观察菌落数目。

(4)制备选择培养基（尿素为唯一氮源）

制备牛肉膏蛋白胨培养基.相同的菌液，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。

思考？为什么还要制备牛肉膏蛋白胨培养基？

（对照作用）

如果是初次实验，稀释范围如何确定？

①

选择涂布的稀释液范围是？至少要几个培养皿进行涂布？

②如何避免这么多的试管和培养皿混淆？（P25）

培养不同微生物往往需要不同培养温度。

细菌：30～37℃培养1～2d

放线菌：25～28℃培养5～7d

霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。

在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。

选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。

不同种类的细菌形成的菌落，在大小、形状、光泽度、颜色、硬度、透明度等方面具有一度的特征，菌落特征可作为菌种鉴定的重要依据。

三、操作提示

[一]无菌操作

1、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。

2、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。

3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。

[二]做好标记

注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。

四、结果分析与评价

1.培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落？

对照的培养皿无菌落说明培养基没有污染。

牛肉膏培养基的菌落数目多余选择培养基的菌落数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。

四、结果分析与评价

2.获得某一稀释度下，菌落数30～300的平板，在这以稀释度下是否至少有两个平板的菌落数相接近？

相接近，说明操作成功。

五、课题延伸

1.在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。

2.测定饮水中大肠杆菌数量的方法是将一定体积的水用细菌过滤器过滤后，将滤膜放到

伊红-美蓝

培养基上培养，大肠杆菌菌落呈现黑色，通过记算得出水样中大肠杆菌的数量。

大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征

:大肠杆菌呈深紫色,中心有或无金属光泽

巩固练习

1.使用选择培养基的目的是（

）

A.培养细菌

B.培养真菌

C.使需要的微生物大量繁殖

D.表现某微生物的特定性状与其他微生物加以区别

2.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分别是(

)

A.CO2和N2

B.葡萄糖和NH3

C.CO2和尿素

D.葡萄糖和尿素

3.下列说法不正确的是（ ）

A.科学家从70－80度热泉中分离到耐高温的TaqDNA聚

合酶。

B.统计某一稀释度的5个平板的菌落数依次为M1、M2、

M3、M4、M5，以M3作为该样品菌落数的估计值。

C.设置对照实验的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度

D.同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量最大，种类最多。

4.为培养和分离出酵母菌并淘汰杂菌，常在培养基中加入（

）

A.较多的氮源物质

B.较多的碳源物质

C.青霉素类药物

D.高浓度食盐

5、实验测定链霉素对3种细菌的抗生素效应，用3种细菌在事先准备好的琼脂块平板上画3条等长的平行线（3条线均与下图中的链霉素带接触），将平板置于37℃条件下恒温培养3天，结果如图所示。从实验结果分析以下叙述，不正确的是 A链霉素能阻止结核菌的生长

B链霉素对结核菌比对霍乱菌更有效

C链霉素对结核菌比对伤寒菌更有效

D链霉素可以用于治疗伤寒病人