课题3　血红蛋白的提取和分离教案2

总第

教时

【授课时间：第

周

星期

】

5.3

血红蛋白的提取与分离（第1课时）

课题目标

本课题通过尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，使学生能够体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理，为今后学习运用这些技术打下基础。

课题重点和难点

课题重点：凝胶色谱法的原理和方法。

课题难点：样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的填装。

教法设计

通过阅读，回忆原有知识，发现其新的具体应用；发现新问题，通过师生共同探讨，初步解决新问题，获得新知识；有效完成对课题知识的学习。

通过设计，将习得的课题知识在自设的新情境中加以应用；发现新问题，通过师生共同探讨，初步解决新问题，获得新知识；初步完成课题知识的实践应用。

通过操作，在实践中检验个人设计的合理性；发现新问题，通过师生共同探讨，初步解决新问题，完善设计，获得新知识、新体验、新技能；有效完成课题知识的实践应用。

教学过程及内容

师（引）：（明确提取的难度）本专题课题1有关DNA的粗提取相对是比较简单的。而提取象蛋白质这样对温度、盐浓度、PH等条件十分敏感，极易失活；空间结构多样，理化性质各异的生物大分子。没有一种统一的方法，提取难度要大得多。

（明确提取的重要性和必要性）但就目前生物科学的发展而言，提取蛋白质又十分重要和必要，因此安排了这样一个课题。

速读课题背景部分，了解提取蛋白质的重要性和必要性。

生：阅读、标注、认同重要性和必要性。

师：要在中学实验室成功提取蛋白质，必须具备相应的基础知识。细读基础知识部分前两段及图5-13，就凝胶色谱法的原理、方法与过程给出自己的理解。

生：阅读，标注，同桌表述及相互评价，推荐表述。

师生：确认或校正。

一、基础知识

蛋白质提取原理：利用蛋白质各种特性差异实现分离；特性包括分子形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等。

（一）凝胶色谱法（分配色谱法）

1．原理：利用蛋白质相对分子质量大小实现分离。

2．凝胶特征

（1）理化：多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成；微小的多孔球体，球体内有贯穿的通道。

（2）分离：相对分子质量不的蛋白质分子会进入球体内通道移动，路程较长，速度较慢；大的则从球体外间隙移动，路程较短，速度较快。

3．方法与过程：

蛋白质混合物

↓

凝胶色谱柱（层析柱）

↙

洗脱

↘

相对分子质量小的蛋白质分子

相对分子质量大的蛋白质分子

↓

↓

进入凝胶内部通道

通过凝胶外部（间隙）

↓

↓

路程长、移动慢

路程短，移动慢

↓

↓

先流出

后流出

↘

分离

↙

师：此方法还可用于测定蛋白质的分子量和蛋白质的脱盐等。

在上述过程中用于洗脱的液体是缓冲溶液，之前的学习中已有涉及。速读“缓冲溶液”部分内容，就其作用体现、特性、重要意义给出自己的理解。

生：阅读，标注，同桌表述与评价，同桌推荐作答。

师生：确认或校正

（二）缓冲溶液

1．体现：在一定范围内，能够抵制外界的酸或碱对溶液PH的影响，维持PH基本不变。

2．特性

（1）成分：1~2种缓冲剂的水溶液；（如碳酸盐缓冲液Na2CO3/NaHCO3，磷酸缓冲液Na2HPO4/ NaH2PO4）

（2）PH：可通过控制缓冲剂使用比例制得在不同PH范围内使用的缓冲液。

3．重要意义：生物化学反应都需一定的PH，缓冲溶液的准确配制及PH的准确测定，在研究中有重要意义。

师：上述缓冲注解除用作洗脱液外，在另一种生物大分子分离技术中也经常用到，就是电泳。细读“电泳”部分内容和图5-15、5-16，就其原理、方法和过程，及与凝胶色谱法的区别给出自己的理解。

生：阅读，标注，同桌表述与评价，同桌推荐作答。

师生：确认或校下正。

（三）电泳

1．定义：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。

2．原理：利用各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电粒子产生不同的迁移速度，实现分离。

3．过程与方法

生物大分子（多肽、核酸等）

↓解离

基因

↓一定PH 基因带上正电或负电

↙

电场作用

带正电基团1、基团2移向阴极

↓

↓

↘

分子较小

分子较大

分离1 ↓

↓

迁移较快

迁移较慢

↘

↙

分离2

作业练习： 1．学案练习：随堂完成，即时校正。

2．书本训练：当堂完成并校正。

3．练习册练习：课后完成。

课后小结：

↘

带负电基团移向阳极

↙

总第

教时

【授课时间：第

周

星期

】

5.3

血红蛋白的提取与分离（第2课时）

课题目标

本课题通过尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，使学生能够体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理，为今后学习运用这些技术打下基础。

课题重点和难点

课题重点：凝胶色谱法的原理和方法。

课题难点：样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的填装。

教学过程及内容

师：承上课

4．常用电泳方法

（1）琼脂糖凝胶电泳：用于分离核酸、多肽等大分子，分率率较低，水平方向。（参图5-15进行图片描述）

（2）聚丙烯酰胺凝胶电泳（以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳为例）

①用途：测定蛋白质的分子量；（单条肽链的分子量）

②凝胶：单体丙烯酰胺与N，N`-亚甲基双丙烯酰胺聚合关联成有三维网状结构。

③原理：

蛋白质：迁移率取决于所带净电荷的多少及分子大小等因素；

SDS：消除净电荷对迁移率的影响。

能使蛋白质完全变性，解聚成肽链，并形成蛋白质-SDS复合物；

SDS所带大量负电荷掩盖了蛋白质分子原有电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子大小。

师：有了以上相关基础知识后，就可以进行实验操作了。速读实验操作首节及样品处理部分内容。就提取分离的步骤，样品处理的和粗分离步骤、方法和过程进行记忆，并给出自己的理解。

生：阅读，标注，记忆，同桌表述和评价，同旧推荐作答。

师生：确认或校正评价。

二、实验操作

蛋白质得取和分离步骤（四步）：样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定；

分离纯化方法差异：因来源和性质不同有很大差异。

（一）样品处理（1、2、3）

选材概念图：脊椎动物血液

↓

↓

血浆

血细胞→红细胞最多→90%血红蛋白

↓

四条肽链（2个α2个β）

↓

每条肽链一个亚铁血红素基团

↓

↓

此基团可携带1分子氧或二氧化碳

呈现红色

1．红细胞洗涤

（1）目的：去除杂蛋白（血浆蛋白），以利于分离纯化；

（2）过程与方法

血样（全血）

↓低速短时离心，分层

↓吸出上层黄色血浆（或液体）←

红细胞

↓加入五倍体积生理盐水（0.9%NaCl）

重得三次，至上清液没有黄色止。

↓缓慢搅拌

↓低速短时离心，分层

2．血红蛋白的释放：加蒸馏水和甲苯，搅拌；使红细胞破裂，释放出血红蛋白；

3．分离血红蛋白溶液

混合液

↓高速10min离心，分4层（参图5-18）

液体部分（去第4层）

↓滤纸过滤，去脂溶性沉淀（第2层）

滤液（去第2层）

↓分液漏斗静置，分液（去第1层）

下层红色透明液体（即为血红蛋白溶液）

作业练习： 1．学案练习：随堂完成，即时校正。

2．书本训练：当堂完成并校正。

3．练习册练习：课后完成。

课后小结：

总第

教时

【授课时间：第

周

星期

】

5.3

血红蛋白的提取与分离（第2课时）

课题目标

本课题通过尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，使学生能够体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理，为今后学习运用这些技术打下基础。

课题重点和难点

课题重点：凝胶色谱法的原理和方法。

课题难点：样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的填装。

教学过程及内容

师：承上课

4．透析（粗分离）

（1）目的：去除分子量较小的杂质；

（2）方法：血红蛋白溶液装入透析袋，于磷酸缓冲液中透析12小时

师：以上1、2、3步实际是提取与分离四步骤中的第一步样品处理，第4步属四步骤中的第二步粗分离。通过这四步实现血红蛋白的粗分离。进一步的分离纯化要使依靠凝胶色谱柱来实现，这就涉及凝胶色谱柱的制作和使用了。速读“凝胶色谱操作”部分内容，就其制作、装填及使用进行记忆并给出自己的理解。

生：阅读，标注，同桌表述评价，同桌推荐作答案。

师生：确认或校正评价。

（二）凝胶色谱操作

1．凝胶色谱柱的制作（结合文字和图5-19，描述）

（1）玻管内径应<2cm（内径不影响分离效果，但会造成洗脱液体积过大，血红蛋白质的稀释度过大）

（2）玻管长度应<1m（高度会影响分离效果）

（3）上下口橡皮塞：上口打孔插玻璃管；下口内凹，履尼龙网和尼龙纱，打孔插移液管头，并过加螺旋夹的尼龙管。

2．凝胶色谱柱的装填

（1）凝胶：交联葡聚糖凝胶（颗粒状）；

（2）用量计算：因干凝胶与缓冲液平衡后的凝胶体积差别很大；

（3）蒸馏水溶胀：凝胶，制成悬浮液；

（4）垂直装填：下口打开，将悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱。装填要均匀且没有气泡；

（5）洗涤平衡凝胶：立即，磷酸缓冲液，50cm高操作压，12h，使凝胶装填紧密。

3．样品的加入和洗脱

（1）加样前：打开下口，放出部分缓冲液到与凝胶面平齐；

（2）加样：用吸管吸1ml透析后样品，沿管壁环绕移动加入样品；

（3）样品渗入凝胶床：打开下口，完全渗入后关闭；

（4）洗脱：沿管壁环绕移动加缓冲液至适当高度，连接洗脱瓶，打开下品进行洗脱。

（5）收集：红色蛋白质接近色谱柱底时，收集流出液，每5ml一管。

（三）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

蛋白质纯度度鉴定中使用最多的方法。

师：以上步骤（二）是提取与分离四步中的第三步纯化，以上步骤（三）是提取与分离步骤中的第四步纯度鉴定。

至此完成血红蛋白提取和分离实验全过程。

在实际操作中，为保证实验成功，还须注意一些操作，可通过阅读操作提示部分了解。共读操作提示，了解这些注意点。

三、操作提示

1．红细胞的洗涤

（1）洗涤次数：过少，无法除去血浆蛋白；

（2）离心速度和时间：过高、过长，会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。

2．色谱柱填料的处理

（1）商品凝胶是干燥颗粒，使用前需直接放在洗脱液（磷酸缓冲液）中膨胀。

（2）加速膨胀：沸水浴（逐渐升温至接近沸腾），可节约时间、除去微生物、排除空气等。

3．凝胶色谱柱的装填

（1）尽量紧密，降低颗粒间的间隙；

（2）不得有气泡，气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果；

（3）操作过程中不能发生洗脱液流干，露出凝胶的现象。一量发生需重新装填。

（4）蛋白质的分离：红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功。

（四）结果分析与评价（操作后进行）

（五）课题延伸（略）。

作业练习： 1．学案练习：随堂完成，即时校正。

2．书本训练：当堂完成并校正。

3．练习册练习：课后完成。

课后小结：