课题3　分解纤维素的微生物的分离教学设计(第二课时)

分解纤维素的微生物的分离--教学设计

一、课题目标

简述纤维素酶的种类及作用，从土壤中分离出分解纤维素的微生物，讨论这类微生物的应用价值。

二、课题重点与难点

课题重点：从土壤中分离分解纤维素的微生物。

课题难点：从土壤中分离分解纤维素的微生物。

三、课题背景分析

教材首先说明了纤维素的化学组成以及纤维素在生物圈的广泛分布，由此转入到如何对纤维素进行有效利用的问题。接着，教材介绍了产纤维素酶的微生物能够分解纤维素，因此，对纤维素的利用离不开对分解纤维素的微生物的研究。最后，教材点明了本课题的研究主题，即从土壤中分离能够分解纤维素的微生物。

教学工具

多媒体

四

、教学过程设计

（一）引入新课

上节课我们探讨学习了土壤中尿素分解菌的分离与计数，这节课我们以纤维素分解菌的分离与纯化为例，巩固加深对这方面技术的理解和掌握。

（二）进行新课

活动1：阅读“纤维素与纤维素酶”，回答下列问题：

1．1纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是含量最丰富的多糖类物质。纤维素能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。

延伸：草食性动物是怎样消化食物中纤维素的？肠胃中的共生物生物。

1．2棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物。纤维素的分解需要在纤维素酶的催化作用下完成，请完成下列过程：

〖思考1〗实验分析：P27的小实验是如何构成对照的？

在一支试管中添加纤维素酶，另一支试管不添加纤维素酶；尽管醋酸－醋酸钠缓冲液用量不同，但都能维持相同的pH。

1

〖思考2〗1个酶活力单位是指在温度为 25 ℃，其它反应条件最适宜情况下，在 1 min内转化 1mmol 的底物所需要的酶量。

试管

1

滤纸条

1 cm×6 cm 缓冲液

pH＝4.8

10 mL

纤维素酶

(70～80U/mL)

1 mL

条结果

将两支试管固定在

50 mL 的完全分解

锥形瓶中，在

摇床上以

140 r/min 的转速振荡反应

1 h 基本无变化

2

1 cm×6 cm 11 mL

/

结论

纤维素酶能分解纤维素

活动2：阅读“纤维素分解菌的筛选”，回答下列问题：

2.1筛选纤维素分解菌的方法是刚果红染色法。该方法可以通过颜色反应直接筛选。

其原理是：刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，红色复合物无法形成，出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

2.2培养基

(1)纤维素分解菌的选择培养基或称为富集培养基(液体培养基)，该培养基中富含的碳源为纤维素粉，而不是以纤维素为唯一碳源的培养基，所以在培养过程中除得到大量的纤维素分解菌外，也有其他微生物的存在，但只有以纤维素为碳源的微生物才能大量繁殖，因此纤维素分解菌占优势地位；该选择培养基的目的是：利用这种培养基可以增加纤维素分解菌的浓度，以确保能从样品中分离到所需要的微生物。

培养基组分

纤维素粉

NaNO3

Na2HPO4·7H2O

KH2PO4

MgSO4·7H2O

含量

5 g

1 g

1.2 g

0.9 g

0.5 g

0.5 g

0.5 g

生长因子、碳源、氮源

氮源、生长因子

0.5 g

将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到

1 000 mL 2 提供的主要营养

碳源

氮源、无机盐

无机盐

KCl

酵母膏

水解酪素

(2)鉴别纤维素分解菌的鉴别培养基(固体培养基)，在该培养基中加入刚果红溶液，在该培养基上生长的纤维素分解菌分 泌纤维素酶，因此菌落周围会形成透明圈。

培养基组分

CMC－Na

酵母膏

琼脂

土豆汁

含量

5～10 g

1 g

0.25 g

15 g

提供的主要营养

碳源

碳源、氮源、生长因子

无机盐

凝固剂

碳源、生长因子

KH2PO4

100 mL

将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到

1 000 mL 2.3 筛选方法：刚果红(CR)染色法

项目

内容

方法一

(先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应)

培养基上长出菌落→覆盖质量浓度为

1 mg/mL 的

CR 10～15 min

溶液

―――――→

倒去

CR 溶液→加入物质的量浓度为15 min

1mol/L NaCl 溶液――→倒掉

NaCl 溶液→出现透明圈

方法二

(在倒平板时就加入刚果红)

配制质量浓度为

10 mg/mL 的

CR 溶液→灭菌→按

照

1 mL CR/200 mL

培养基比例混匀→倒平板操作简便，不存在菌落混杂问题

①由于琼脂、土豆汁中均含有淀粉类物质，可能

使产生淀粉酶的微生物也形成透明圈，即假阳性

反应；②有些微生物具有降解色素的能力，它们

会降解刚果红形成透明圈，与纤维素分解菌不易

区分

过程

优点

显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用，鉴

定明确

缺点

制作繁琐，加入刚果红会使菌落之间发生混杂

活动3：实验设计，完成实验方案流程图，讨论回答问题：

(2)具体操作：

①土壤取样：选择富含纤维素的环境，用无菌的小铁铲铲去表层土，迅速铲取土壤装入无菌信封，密封。(备注：采集

土样时，选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落3

叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等。还可以将富含纤维素的物

质，如滤纸等，埋在土壤中，经过 30d 左右，再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌)

②选择培养(或富集培养或扩大培养)：

★配置选择培养基：目的是增加纤维素分解菌的浓度，以确保能从样品中分离到所需要的微生物。

★操作过程：称取土样 20 g――――→加入装有 30 mL 选择培养基的锥形瓶中―――→ 将锥形瓶固定在摇床上30℃下振荡培养1~2d―――→培养液变混浊――→吸取一定量的培养液(如

5 mL)―――→转移至另一瓶新鲜的选择培养基中―――→摇床上振荡培养―――→培养液变混浊

③梯度稀释：用移液管从选择培养基中吸取 1mL 培养液，注入盛有 9mL 无菌水的试管中，吹吸三次，使充分混匀；用

移液管从此试管中吸取 1mL 菌液注入另一支盛有

9mL 无菌水的试管中，依次类推，分别配置成 101、102、103、104、

105、106 倍的各种稀释液，并做好标记。

④涂布培养：

★配置鉴别培养基：目的是初步对纤维素分解菌进行鉴定

★操作过程：将稀释液用涂布器涂布到已经制备好的鉴别纤维素分解菌的培养基上，将平板倒置于

30~37℃的恒温箱中

培养 1~2d，每隔 24h 观察菌落的生长情况。

⑤挑选菌落：通过刚果红染色法，挑选产生透明圈的菌落。

备注：

★在实验操作中，土壤取样、选择培养、梯度稀释、涂布培养步骤都必须注意无菌操作。

4

★纤维素分解菌的纤维素酶位于细胞膜上，分解纤维素时需要附着在纤维素上，而真菌、放线菌的纤维素酶是胞外酶，

能分泌到培养基中，可以通过过滤、离心获得真菌、放线菌中的纤维素酶。

★酶活力=透明圈直径/菌落直径

5.结果分析与评价：

①取样：适于纤维素分解菌繁殖的富含纤维素的环境中会有较多的纤维素分解菌。

②选择培养基是否筛选出菌落：在实验组培养基上，如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能(因为形成透明圈的菌

落与其他微生物菌落可能出现混杂现象，而且产生透明圈的菌落可能是产生淀粉酶的微生物，也可能是降解刚果红的菌

种)获得了纤维素的微生物。

③分离结果的一致性：由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌，因此最容易分离得到的是细菌。但由于取土样

的环境不同，还可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。

6.纤维素分解菌的进一步鉴定：

对通过刚果红染色法分离得到的纤维素分解菌需进行进一步发酵产纤维素酶的实验来鉴定，其原因是形成的菌落可能与

其他菌落混杂，产生透明圈的菌落可能是产生淀粉酶的微生物形成的，还可能是降解刚果红的菌种形成的，因此需进一

步鉴定。 (1)鉴定原理：

通过微生物发酵，看能否产生纤维素酶。发酵的方法分为固体发酵和液体发酵。若发酵产物中有纤维素酶，则菌种是纤

维素分解菌。

(2)纤维素酶的鉴定方法：

通过鉴定纤维素酶水解纤维素产生的葡萄糖，来鉴定纤维素酶的产生。葡萄糖与斐林试剂在

50~65℃水浴条件下共热

1~2min，可形成砖红色沉淀，以此判断微生物是否产生了纤维素酶。

〖思考3〗实验流程中“选择培养”的培养基类型是什么？该培养的目的是什么？

液体选择培养基。其目的是使纤维素分解菌增殖，含量增多。

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〖思考4〗本实验流程与尿素分解菌的分离实验流程有哪些异同？

尿素分解菌的分离实验流程是将土样制成的菌悬液直接涂布在选择培养基上；本课题通过选择培养使细菌增殖后，再涂布在鉴别培养基上。其它操作基本基本共同。

活动4：阅读资料一“土壤取样”，回答下列问题：

2．1纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中。

2．2为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？

生物适应一定环境，环境对生物具有选择作用，只有在纤维素含量丰富的环境中纤维素分解菌的含量才会高于其它普通环境，从而提高获得目的微生物的几率。

2．3将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋进土壤多深？

人工设置适宜环境，使纤维素分解菌相对聚集。将纸埋于深约250px的腐殖土壤中。

活动5：阅读资料二“选择培养基”，回答以下三个问题：

2．4纤维素分解菌选择培养基属于液体培养基，原因是没有添加琼脂成分。

2．5培养基选择作用机制是以纤维素粉为唯一碳源，只有纤维素分解菌才能生存。

2．6若设置一个对照实验说明选择培养的作用，应控制的变量是将纤维素粉改为葡萄糖。

活动5：阅读资料三“刚果红染色法”，填表比较两种染色法的各自的优缺点：

〖思考5〗为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？

在选择培养条件下，可使能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。

3．结果分析与评价

活动6：阅读“课题延伸”，回答：

3．1为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行 发酵产纤维素酶 实验，纤维素酶的发酵方法有 液体 发酵和 固体 发酵。

3．2纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的 葡萄糖 含量进6

行定量测定。

课后小结

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