复习与测试设计意图

专题4 酶的研究与应用

课题3 酵母细胞的固定化

一、【课题目标】

（一）知识与技能

1、识记固定化技术的常用方法

2、掌握固定化酵母细胞的制备过程

（二）过程与方法

1、固定化细胞技术

2、制备固定化酵母细胞的过程

（三）情感、态度与价值观

1、通过固定化技术的发展过程，培养科学探究精神，同时领会研究的科学方法

2、学生们通过做实验学习实验过程和实验结果的同时体验做实验的愉悦感。

二、【课题重点】

制备固定化酵母细胞

三、【课题难点】

制备固定化酵母细胞

四、【教学方法】

启发式教学

探究式教学

五、【教学工具】

多媒体课件

六、【教学过程】

（一）引入新课

在应用酶的过程中，人们发现了一些实际问题：酶通常对强酸、强碱、高温和有机溶剂等条件非常敏感，容易失活；溶液中的酶很难回收，提高了生产成本，也可能影响产品质量。在本课题中，我们将动手制备固定化酵母细胞，体会固定化酶的作用

（二）进行新课

1．基础知识

1．固定化酶的应用实例――生产高果糖浆

（1）高果糖浆的生产原理：

（2）葡萄糖异构酶固定：将葡萄糖异构酶固定在颗粒状载体上，装入反应柱中。

（3）高果糖浆的生产操作：

从反应柱上端注入葡萄糖溶液，从下端流出果糖溶液，一个反应柱可连续使用半年。

2．固定化技术的方法：

将酶和细胞固定化方法有包埋法、化学结合法和物理吸附法。

【比较】酶和细胞的固定方法和特点

固定对象

适宜固定法

特点

容易丢失

学结合和吸附

〖思考1〗对固定酶的作用影响较小的固定方法是什么？吸附法。

〖思考2〗将谷氨酸棒状杆菌生产谷氨酸的发酵过程变为连续的酶反应，应当固定（酶、细胞）；若将蛋白质变成氨基酸，应当固定（酶、细胞）。

3．固定细胞的材料：

固定细胞时应当选用不溶于水的多孔性载体材料，如明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等

2．实验设计

1．制备固定化酵母细胞

（1）酵母细胞的活化：

1g干酵母＋10mL蒸馏水→50mL烧杯→搅拌均匀→放置1h，使之活化。

〖思考3〗活化是指让处于休眠状态的微生物重新恢复正常生活状态的过程。

酶

化学结合法、物理吸附法

体积小，固定一种酶。包埋法细胞

包埋法

体积大，固定一系列酶。难以化

（2）配制CaCl2溶液：

0.83gCaCl2＋150mL蒸馏水→200mL烧杯→溶解备用。

（3）配制海藻酸钠溶液：

0.7g海藻酸＋10mL水→50mL烧杯→酒精灯微火（或间断）加热，并不断搅拌，使之溶化→蒸馏水定容到10mL。

〖思考4〗微火加热并不断搅拌的目的是什么？防止海藻酸南焦糊。

（4）海藻酸钠溶液与酵母细胞的混合：

将溶化的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入活化酵母细胞液，搅拌后吸入到注射器中。

〖思考5〗为什么要海藻酸钠溶液冷却后才能加入酵母细胞？

防止高温杀死酵母细胞。

（5）固定化酵母细胞：

以恒定速度缓慢地将注射器中的溶液滴加到CaCl2溶液中，形成凝胶珠状颗粒。

2．固定化酵母细胞的发酵

（6）冲洗：将固定的酵母细胞凝胶珠用蒸馏水冲洗2～3次。

（7）发酵：150mL10％葡萄糖＋固定化酵母细胞→200mL锤形瓶→密封→25℃发酵24h。

〖思考6〗发酵过程中锥形瓶为什么要密封？

酵母菌的酒精发酵需要缺氧条件。

〖思考7〗锥形瓶中的气泡和酒精是怎样形成的？酵母菌进行无氧呼吸产生的。

〖思考8〗在利用固定化酶或固定化细胞进行生产的过程中，需要无菌操作码？

需要。

3.固定化酵母细胞的对比实验设计

（1）.制定固定化酵母细胞的时候如果要对照高浓度的海藻酸钠和标准浓度的海藻酸钠的实验效果，想想如何设计实验？

在该实验中单一变量是谁？无关变量和因变量是谁？并填写下列表格

单一变量

无关变量

因变量

（2）.注意：在混合液滴入CacL2中的过程中注意高度一般在15-20厘米之间，太低不容易形成凝胶珠，太高溶液会溅出。

（3）.思考：用固定化酵母细胞发酵时想一想我们如何检测酵母细胞是否发酵？

（三）课堂总结、点评

本实验需特别注意注射器离氯化钙溶液液面的高度，如果高度过高液滴会溅出，高度过低，不容易形成球形或椭球形的凝胶珠，而学生失败的大多数原因就是因为没有把握好高度。课堂上有个遗憾的地方就是没让学生做的结果充分展示一下，可能导致个别学生对实验结果印象不深。

（四）巩固练习

判断

（1）应使干酵母与自来水混合并搅拌，以利于酵母细胞活化（

）

（2）配置海藻酸钠溶液时要用小火或间断加热（

）

（3）向刚融化好的海藻酸钠溶液中加入已活化的酵母细胞，充分搅拌（）

（4）将酵母细胞与海藻酸钠的混合液注入CacL2中，会观察到有球形或椭球形的凝胶珠形成（

）

（5）在CacL2中形成凝胶珠后要立即冲洗凝胶珠并加入葡萄糖溶液中（

）

（6）海藻酸钠浓度过高时不容易形成圆形或椭圆形的凝胶珠（

）

(五) 实验易考内容再总结：

（1）CacL2溶液的作用：使海藻酸钠胶体发生聚沉，形成凝胶珠

（2）酵母细胞的活化，配置CacL2溶液，配置海藻酸钠溶液，冲洗凝胶珠均用蒸馏水而不是自来水

(3)海藻酸钠加热时要用小火或者间断加热的方法

(4)融化好的海藻酸钠溶液冷却至室温才能加入活化的酵母菌

(5)固定化酵母细胞时要用注射器缓慢地将混合溶液滴加到配置好的CacL2溶液中，而非注

射

(6)凝胶珠在CacL2溶液中需浸泡30分钟左右，并用蒸馏水冲洗后才能进行酵母细胞的发酵

(7)海藻酸钠溶液浓度过低，固定的酵母细胞数目较少；浓度过高不易形成圆形或椭圆形的凝胶珠。

七、【教学体会】

固定化酶的技术要求比较高，因此在教学过程中重点介绍固定化酵母细胞的操作。我们通过实验让学生体会固定化酵母细胞的操作过程，以及通过对比凝胶珠的形状和颜色，使学生们比较实验结果的成功与否，从而探究在实验操作中应该如何把握实验的操作过程

八、【资料袋】

固定化细胞的载体

固定化细胞技术所采用载体的物理化学性质直接影响所固定细胞的生物活性和体系传质性能。理想的载体材料应具有对微生物无毒性、传质性能好、性质稳定。寿命长、价格低廉等特性。它可分为有机高分子载体、无机载体和复合载体三大类。

有机高分子载体又分为天然高分子凝胶载体和合成有机高分子凝胶载体。天然高分子凝胶一般对生物无毒，传质性能较好，但强度较低，在厌氧条件下易被生物分解。有机合成高分子凝胶载体一般强度较大，但传质性能较差，在进行细胞固定时对细胞活性有影响，易造成细胞失活。

无机载体大多具有多孔结构，在与微生物接触时，利用吸附作用和电荷效应，从而把微生物固定。它的操作方法是把载体放人含有一定微生物浓度的溶液中，固定一段时间（24h左右）即可。

由有机载体和无机载体材料组成的复合载体材料，可以改进载体材料的性能。Lin等将粉末活性炭和Phanerochaetechrysosporium联合包埋固定，结果表明了复合固定化体系能更加有效地用于降解五氮酚，显示出复合载体材料的优越性。