附录4　常用的消毒灭菌操作方法优秀课堂实录

第40讲

微生物的利用

[考纲要求] 1.微生物的分离和培养。2.某种微生物数量的测定。3.培养基对微生物的选择作用。

考点一

微生物的分离与培养[重要程度：★★☆☆☆]

1．培养基

(1)概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。

(2)营养构成：一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。此外，还需要满足微生物生长对pH、氧气以及特殊营养物质的要求。

(3)种类：按照物理性质可分为液体培养基和固体培养基。

2．无菌技术

(1)含义：指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。

(2)关键：防止外来杂菌的入侵。

(3)不同对象的无菌操作方法[连线]

3．大肠杆菌的纯化培养

(1)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基

计算→称量→溶化→灭菌→倒平板

(2)纯化大肠杆菌的方法

①纯化培养原理：想方设法在培养基上得到由一个细胞繁殖而来的肉眼可见的菌落，即可获得较纯的菌种。

②纯化大肠杆菌的关键步骤：接种。

③常用的微生物接种方法有两种

a．平板划线法：是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。

b．稀释涂布平板法：是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。

(3)菌种的保存方法

①对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。

1

②对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。

1．消毒和灭菌的不同点

比较项目

消毒

灭菌

项目

平板划线法

优点

可以观察菌落特征，对混合菌进行分离

可以计数，可以观察菌落特征

缺点

不能计数

吸收量较小，较麻烦，平稀释涂布平板法

板不干燥效果不好，容易蔓延

3. 稀释涂布平板法统计样品中菌落的数目往往比实际数目低，为什么？

答案

这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。

4．平板划线法纯化大肠杆菌时不同阶段灼烧接种环的目的不同：

(1)第一次操作：杀死接种环上原有的微生物。

(2)每次划线之前：杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端。

(3)划线结束后：杀死接种环上残存的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。

易错警示

配制牛肉膏蛋白胨固体培养基的注意事项

(1)倒平板的适宜温度是50 ℃左右，温度过高会烫手，过低培养基又会凝固。

(2)平板需倒置，这样既可使培养基表面的水分更好地挥发，又可防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。

理化因素的作用强度

较为温和

强烈

消灭微生物的数量

部分生活状态的微生物

全部微生物

芽孢和孢子能否被消灭

不能

能

2.两种纯化细菌方法优缺点的比较

1．下列有关微生物培养与应用的说法，正确的是

(

) A．天然培养基是指直接取自自然界不需加工的培养基

B．接种前需对培养基、培养皿、接种环、实验操作者的双手等进行严格的灭菌处理

C．大肠杆菌的纯化培养过程包括培养基的配制和纯化大肠杆菌两个阶段

D．分离分解尿素的细菌时，尿素是培养基中唯一的氮源和碳源

答案

C 解析

天然培养基是成分不明确的培养基，并不是不需加工配制的培养基；实验者的双

2

手需进行消毒处理；分离分解尿素的细菌时，尿素是唯一的氮源而不是唯一的碳源。

2．有些细菌可分解原油，从而消除由原油泄漏造成的土壤污染。某同学欲从受原油污染的土壤中筛选出能高效降解原油的菌株。回答问题：

(1)在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以________为唯一碳源的固体培养基上。从功能上讲，该培养基属于________培养基。

(2)纯化菌种时，为了得到单菌落，常采用的接种方法有两种，即__________________和______________________。

(3)为了筛选出高效菌株，可比较单菌落周围分解圈的大小，分解圈大说明该菌株的降解能力__________________。

(4)通常情况下，在微生物培养过程中，实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌、__________和____________________。无菌技术要求实验操作应在酒精灯________附近进行，以避免周围环境中微生物的污染。

答案

(1)原油

选择

(2)平板划线法

稀释涂布平板法(3)强

(4)干热灭菌

高压蒸汽灭菌

火焰

解析

(1)可以将所需要的微生物从混杂的微生物群中分离出来的培养基为选择培养基。欲筛选出能降解原油的菌株，则培养基中应只含有原油而无其他碳源，这样不能降解原油的细菌在此培养基上不能生存，能降解原油的细菌才能在只含原油这一碳源的培养基上生存。(2)分离纯化菌种时，接种的方法有平板划线法和稀释涂布平板法，其目的都是使聚集在一起的微生物分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单菌落，以便于纯化菌种。(3)降解原油能力越强的菌株，在菌落周围形成的分解圈越大。(4)实验室常用的灭菌方法有灼烧灭菌(如接种环)、干热灭菌(如培养皿)和高压蒸汽灭菌(如培养基)等。无菌技术要求整个实验操作都要在酒精灯火焰附近进行，以避免周围微生物的污染。

考点二

微生物的筛选和计数[重要程度：★★☆☆☆]

一、土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

1．分离原理：土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起到催化作用。

2．统计菌落数目：统计样品中的活菌一般用稀释涂布平板法。

3．实验流程：土壤取样→样品的稀释→微生物的培养与观察→细菌的计数。

二、分解纤维素的微生物的分离

1．纤维素酶

(1)组成：纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶。

(2)作用

C1酶葡萄糖苷酶纤维素――→纤维二糖――→葡萄糖

Cx酶

3

2．纤维素分解菌的筛选

(1)原理

纤维素分解菌

↓

刚果红纤维素酶→红色复合物――→红色消失，出现透明圈

纤维素

(2)筛选方法：刚果红染色法，即通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

(3)培养基：以纤维素为唯一碳源的选择培养基。

(4)实验流程

土壤取样：富含纤维素的环境

↓

选择培养：用选择培养基培养，以增加纤维素分解菌的浓度

↓

梯度稀释：制备系列稀释液

↓

涂布平板：将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上

↓

挑选产生透明圈的菌落

1．筛选菌株的原则是：人为提供有利于目的菌株生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时抑制或阻止其他微生物的生长。

2．探究菌株筛选原理的不同点

土壤中分解尿素的细菌

①选择培养基的成分：尿素作为唯一的氮源

②鉴定方法：在培养基中加入酚红说明细菌能分解尿素

源

②鉴定方法：刚果红染色法，即刚果红与纤培养基出现以纤维素分解菌为中心的透明圈

分解纤维素的微生物

①选择培养基的成分：纤维素作为唯一的碳指示剂，若指示剂变红，pH升高，维素形成红色复合物，当纤维素被分解后，3. 在微生物的筛选与计数实验中，设置对照实验的目的是：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

4．怎样设置证明培养基未被污染的对照？用空白培养基作对照。

5．怎样设置证明选择培养基选择作用的对照？用牛肉膏蛋白胨培养基接种等量同种菌液作对照。

易错警示

(1)为了使结果接近真实值，应设置三个或三个以上的平板，计算出菌落平均数。

(2)计算时明显偏离实际值(本组实验其他平板计数值)的要舍弃掉后求平均值。

4

(3)对照实验的设计首先要明确设计的目的，分析出实验的自变量之后才能准确设计。

1．下列关于微生物分离和培养的叙述，错误的是 A．微生物培养前，需对培养基进行消毒

B．测定土壤样品中的细菌数目，常用菌落计数法

C．分离土壤中不同的微生物，要采用不同的稀释度

D．分离能分解尿素的细菌，要以尿素作为培养基中的唯一氮源

答案

A 解析

微生物培养前，需对培养基进行灭菌，而不是消毒；测定土壤样品中的细菌数目，

常用菌落计数法；分离土壤中不同的微生物，要采用不同的稀释度，因为不同的微生物在土壤中的含量不同；分离能分解尿素的细菌，要以尿素作为培养基中的唯一氮源。

进行数量的测定。下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题。

实验步骤：(1)制备稀释倍数为10、10、10、10、10的系列稀释液。

(2)为了得到更加准确的结果，你选用______________法接种样品。

(3)适宜温度下培养。

结果分析：(1)测定大肠杆菌数时，在对应稀释倍数为10的培养基中，得到以下几种统计结果，正确可信的是________，其理由是__________________________________________。

A．一个平板，统计的菌落数是230 B．两个平板，统计的菌落数是220和260，取平均值240 C．三个平板，统计的菌落数分别是210、50和520，取平均值260 D．四个平板，统计的菌落数分别是210、300、240和250，取平均值250 (2)一同学在稀释倍数为10的培养基中测得平板上菌落数的平均值为234，那么每毫升样品中的菌落数是________(涂布平板时所用稀释液的体积为0.1 mL)。

(3)用这种方法测定的大肠杆菌密度，实际活菌数量要比测得的数量________，因为_

_______________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。

答案

实验步骤：(2)稀释涂布平板

结果分析：(1)D 在设计实验时，一定要涂布至少三个平板作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性；在分析实验结果时，要考虑所设置的重复组的结果是否合理

(2)2.34×10

(3)多

当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落

解析

实验步骤：为了得到更加准确的结果，应用稀释涂布平板法接种样品。结果分析：(1)选取多个菌落数相差不大的平板计数，取其平均值。(2)234÷0.1×105＝2.34×108。(3)因为菌落可能由两个或多个细菌连在一起生长而成，所以实际活菌数量要比测得的数量多。

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(

) 2．自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后

5

统计菌落数目的方法

(1)显微镜直接计数法

①原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。

②方法：用计数板计数。

③缺点：不能区分死菌与活菌。

(2)间接计数法(活菌计数法) ①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。

②计算公式：每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M，其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数。

③操作：设置重复组，增强实验的说服力与准确性。同时为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。

二级集训

强化素能

高考题组

1．(2013·江苏卷，18)某研究小组从有机废水中分离微生物用于废水处理。下列叙述正确的是

(

) A．培养基分装到培养皿后进行灭菌

B．转换划线角度后需灼烧接种环再进行划线

C．接种后的培养皿须放在光照培养箱中培养

D．培养过程中每隔一周观察一次

答案

B 解析

培养基灭菌后再分装到培养皿中；转换划线角度前要灼烧接种环，冷却后再从上次划线的末端开始进行划线；接种后的培养皿必须放在恒温箱中进行培养，一般每隔12 h或24 h观察一次。

2．(2013·新课标全国卷Ⅱ，39)临床使用抗生素前，有时需要做细菌耐药实验。实验时，首先要从病人身上获取少量样本，然后按照一定的实验步骤操作，以确定某致病菌对不同抗生素的敏感性。回答下列问题：

(1)为了从样本中获取致病菌单菌落，可用____________法或____________法将样本接种于固体培养基表面，经过选择培养、鉴别等步骤获得。

(2)取该单菌落适当稀释，用__________法接种于固体培养基表面，在37 ℃培养箱中培

6

养24 h，使其均匀生长，布满平板。

(3)为了检测该致病菌对于抗生素的敏感性，将分别含有A、B、C、D 四种抗生素的滤纸片均匀置于该平板上的不同位置，培养一段时间后，含A的滤纸片周围出现透明圈，说明该致病菌对抗生素A__________________；含B的滤纸片周围没有出现透明圈，说明该致病菌对抗生素B__________________；含C的滤纸片周围的透明圈比含A的小，说明________________________________________；含D的滤纸片周围的透明圈也比含A的小，且透明圈中出现了一个菌落，在排除杂菌污染的情况下，此菌落很可能是抗生素D的__________________。

(4)根据上述实验结果，为达到抗菌目的，最好应选用抗生素__________。

答案

(1)划线(平板划线) 稀释涂布(或涂布) (2)涂布

(3)敏感

不敏感

该致病菌对C的敏感性比对A的弱

耐药菌

(4)A 解析

微生物纯化的方法主要有平板划线法和稀释涂布平板法。根据微生物的特点对其进行一系列浓度梯度稀释，然后用涂布法接种于固体培养基表面，然后在适宜条件下培养；抗生素是由真菌产生的，可以抑制生长、繁殖或杀死细菌等致病菌的一类物质，含A的滤纸片周围出现透明圈，说明有抗生素A的地方该致病菌受到抑制；B的周围没有透明圈，说明致病菌对抗生素B不敏感，通过C的透明圈要比A的透明圈小，说明该致病菌对C的敏感性比A的弱；D出现了透明圈，说明该致病菌对D敏感，但是在透明圈上出现一个菌落，又排除杂菌污染，判断此菌落的微生物对抗生素D产生了耐药性。根据以上分析，为达到抗菌的目的，最好选择抗生素A。

模拟题组

3．下列是关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述，其中错误的是(双选)(

) A．用自来水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板

B．取10、10、10倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于各组平板上

C．将实验组和对照组平板倒置，37 ℃恒温培养24～48小时

D．确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数

答案

AD 解析

检测土壤中细菌总数，用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板，取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于各组平板上，将实验组和对照组平板倒置，37 ℃恒温培养24～48小时，在确定对照组无菌后，选择菌落数在30～300的一组平板为代表进行计数。

4．从自然界微生物中筛选某菌种的一般步骤是：采集菌样→富集培养→纯种分离→性能测定。

(1)不同微生物的生存环境不同，获得理想微生物的第一步是从合适的环境采集菌样，然后再按一定的方法分离、纯化。培养噬盐菌的菌样应从________________环境中采集。

(2)富集培养指创设仅适合待分离微生物旺盛生长的特定环境条件，使其数量大大增加，从而分离出所需微生物的培养方法。对产耐高温淀粉酶微生物的富集培养应选择____________________的培养基，并在____________条件下培养。

(3)接种前要对培养基进行________________处理。在整个微生物的分离和培养中，一定要注意在______________条件下进行。

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7

(4)如图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图，请分析接种的具体

方法。

获得图A效果的接种方法是______________________，获得图B效果的接种方法是________________。一同学在纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成一片，最可能的原因是________________________，应当怎样操作才可避免此种现象？__________________。

(5)如果探究温度对纤维素酶活性的影响，自变量是____________，应该保持______________________等不变(至少答两项)。

答案

(1)海滩等高盐

(2)以淀粉为唯一碳源

高温

(3)高压蒸汽灭菌

无菌

(4)稀释涂布平板法

平板划线法

菌液浓度过高

增大稀释倍数(或培养过程被杂菌污染

严格无菌操作；或用接种环划下一区域前接种环没有灭菌

每划一个新区域前都要对接种环进行灭菌处理) (5)温度

纤维素的量与浓度、反应时间、pH 解析

(1)筛选菌种应从适于目的菌种生长、繁殖的环境中寻找，故培养噬盐菌应从高盐环境中采集。(2)富集培养时培养基及培养条件应能促进目的菌的生长、繁殖。(3)微生物的分离及培养中必须保证无菌，包括培养基的灭菌和操作过程的灭菌等。(4)纯化培养中接种方法有稀释涂布平板法和平板划线法，前一种方法形成的菌落分布较均匀，后一种方法形成的菌落分布不均匀，先划线的部分菌落密集甚至相连，后划线的部分菌落分布稀疏。(5)探究温度对酶活性的影响时，温度为自变量，酶活性为因变量，其他变量如底物和酶的用量、pH、反应时间等均为无关变量。

1．(2012·北京卷，5)高中生物学实验中，在接种时不进行严格无菌操作对实验结果影响最大的一项是

(

) A．将少许干酵母加入到新鲜的葡萄汁中

B．将毛霉菌液接种在切成小块的鲜豆腐上

C．将转基因植物叶片接种到无菌培养基上

D．将土壤浸出液涂布在无菌的选择培养基上

答案

C 解析

在酿制葡萄酒的过程中，如果灭菌不彻底会影响葡萄酒的品质，但影响不大；在制作腐乳的过程中，发酵过程有多种微生物的参与，所以该过程不进行严格的无菌操作对结果影响不大；在植物组织培养过程中，如果灭菌不彻底，杂菌产生的物质会影响外植体的生长，甚至杀死外植体，导致培养失败，对结果影响最大；土壤浸出液本身就含有大量的杂菌，另外在选择培养基上只能生存我们所要筛选的细菌，所以无菌操作不严格，对结果

8

影响也不会太大。

2．下列无菌操作中，错误的是

(

) A．无菌操作的目的是防止杂菌污染

B．用酒精擦拭双手的方法对操作者进行消毒

C．实验操作过程应在酒精灯火焰附近进行

D．玻璃器皿(吸管、培养皿)可用酒精擦拭

答案

D 解析

对操作者应用较温和的方法进行消毒。实验操作过程应在酒精灯火焰附近进行，防止瓶口的微生物污染培养基。对无菌操作用到的玻璃器皿要用干热灭菌的方法彻底消灭其中的微生物，用酒精擦拭不能达到目的。

3．欲从土壤中分离出能分解尿素的细菌，下列实验操作中，不正确的是(双选) (

) A．将土壤用无菌水进行一系列的梯度稀释

B．同一浓度的土壤稀释液应至少涂布三个平板

C．不可将未接种的培养基在相同条件下培养作为对照

D．用加入刚果红指示剂的培养基可筛选出分解尿素的细菌

答案

CD 解析

为了获得单个菌落，应将土壤用无菌水进行一系列的梯度稀释，A正确；为了使结果更加准确，同一浓度的土壤稀释液至少要涂布3个平板进行重复实验，然后计算平均值，B正确；加入刚果红的培养基用来筛选纤维素分解菌，D错误。

4．苹果醋是指以苹果汁经发酵而成的苹果原醋，再兑以苹果汁等原料而制成的饮品。既有淡淡的醋味，又有果汁的香甜，喝起来非常爽口。下图是苹果醋的制作流程简图，请据图回答下列问题：

(1)过程①中使用到的微生物是__________，属于生态系统成分中的________。若要检测是否产生了酒精可用____________试剂进行检测。

(2)过程②中使用到的微生物是____________，该微生物的代谢类型是____________型。

该微生物可以从食醋中分离纯化获得，方法是：

第一步：配制培养基。该培养基必须含有微生物生长所需要的________________________等基本营养成分。

第二步：对培养基用____________________法进行灭菌。

第三步：接种。微生物常用的接种方法有______________、______________________。

第四步：培养。温度控制在____________。

第五步：挑选符合要求的菌落。

答案

(1)酵母菌

分解者

重铬酸钾

(2)醋酸菌

异养需氧

水、碳源、氮源、无机盐

高压蒸汽灭菌

平板划线法

稀释涂布平板法

30～35 ℃

解析

(1)过程①利用了酵母菌无氧呼吸分解葡萄糖产生酒精的原理。酵母菌属于生态系统中的分解者。(2)过程②中醋酸菌利用培养液中的乙醇生成了醋酸。醋酸菌的代谢类型

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是异养需氧型。对微生物进行培养时，要对培养用具、培养基进行灭菌处理。醋酸菌的最适生长温度为30～35 ℃，故应将培养温度控制在30～35 ℃范围内。

5．急性肠胃炎、手足口病分别是由细菌、病毒通过消化道进入人体导致的。因此检验饮用水中细菌、病毒的含量是有效监控疾病发生的必要措施。请回答下列与检验饮用水有关的问题：

(1)检测大肠杆菌的含量时，通常将水样进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的水样用涂布器分别涂布到琼脂固体培养基的表面进行培养，记录菌落数量，这种方法称为____________________。下图所示的四种菌落分布图中，不可能由该方法得到的是________。

(2)用该方法统计样本菌落数时是否需要对照组？______。为什么？_______________。

(3)有三种材料或用具需要消毒或灭菌：①培养细菌用的培养基与培养皿；②玻棒、试管、烧瓶和吸管；③实验操作者的双手。其中需要消毒的是________，需要灭菌的是______。

(4)已知大肠杆菌能发酵乳糖并产酸产气，现提供足量的已灭菌的乳糖蛋白胨培养液和具塞试管，应如何判断待检水样中是否含有大肠杆菌？

________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。

答案

(1)稀释涂布平板法

D (2)需要

因为需要判断培养基是否被杂菌污染(培养基灭菌是否合格) (3)③

①②

(4)通过无菌操作向试管内注入一定量待测水样。再注入已灭菌的乳糖蛋白胨培养液将试管充满，塞上塞子，混匀后置于37 ℃恒温箱培养24 h。若试管内有气泡生成，则说明水样中有大肠杆菌

解析

(1)平板划线法所得菌落集中呈线状，D的菌落分布情况可判断为平板划线法接种。(2)为判断培养基灭菌是否合格，本实验需要对照。(3)消毒是指使用较温和的物理或化学方法杀死物体表面或内部的部分微生物(不包括芽孢和孢子)。灭菌是指使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。对人的手不能进行灭菌。(4)根据题目意思大肠杆菌能产生气体，可对培养基进行接种观察有无气泡产生来判断大肠杆菌的有无。

6．(1)在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑________、____________和渗透压等条件。由于该细菌具有体积小、结构简单、变异类型容易选择、____________、________________等优点，因此常作为遗传学研究的实验材料。

(2)在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养器皿进行________(消毒、灭菌)；操作者的双手需要进行清洗和________；静止空气中的细菌可用紫外线杀灭，其原因是紫外线能使蛋白质变性，还能________________________________________。

(3)若用稀释涂布平板法计数大肠杆菌活菌的个数，要想使所得估计值更接近实际值，除应严格操作、多次重复外，还应保证待测样品稀释的______________。

10

(4)通常，对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小等菌落特征对细菌进行初步的________________。

(5)培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是_______________________________________________________________ ________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。

(6)若用大肠杆菌进行实验，使用过的培养基及其培养物必须经过________处理后才能

丢弃，以防止培养物的扩散。

答案

(1)温度

酸碱度

易培养

生活周期短

(2)灭菌

消毒

损伤DNA的结构

(3)比例合适

(4)鉴别(或分类) (5)将未接种的培养基在适宜的温度下放置一段时间，观察培养基上是否有菌落产生

(6)灭菌

解析

(1)影响微生物培养的因素除了营养条件外，外界条件主要包括温度、酸碱度和渗透压等。由于大肠杆菌具有体积小、结构简单、变异类型容易选择、易培养、生活周期短等优点，所以常作为遗传学研究的实验材料。(2)对培养基和培养器皿要进行灭菌，对操作者的双手需要进行清洗和用酒精消毒，静止空气中的细菌在用紫外线照射后能够使蛋白质变性，并损伤DNA结构，使细菌死亡。(3)样品的稀释度直接影响平板上生长的菌落的数目，实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得的菌落数在30～300之间。(4)菌落的特征是判断微生物种类的重要依据，对获得的纯菌种可以依据菌落的特征对细菌进行初步检测。(5)要判断固体培养基是否被污染，可将未接种的培养基在适宜的温度下培养一段时间，若发现有菌落说明培养基已被污染。(6)进行微生物培养时，使用过的培养基及培养物必须经灭菌后才能丢弃，防止培养的微生物扩散到环境中，造成危害。

7．请回答下列有关微生物的一些问题。

(1)微生物的分布：微生物主要分布在富含__________的土壤表层；不同微生物对pH的要求不同，细菌常生活在酸碱度________的潮湿土壤中。

(2)微生物的消毒和灭菌：在菊花组织培养中，对外植体常用酒精和______________进行消毒。在微生物培养中，对培养基常用______________方法进行灭菌。如果要检测灭菌是否彻底，可以采用的方法是______________________________________________ ________________________________________________________________________。

(3)微生物的应用：在葡萄酒的自然发酵过程中，运用吸附在葡萄皮上的野生酵母菌发酵产生酒精，请写出该过程的化学反应式：____________________________________。

在果醋制作时，运用醋酸菌在____________和糖源充足时，将糖分解成醋酸。

(4)微生物的接种：微生物接种的方法很多，最常用的是__________________和________________。

(5)微生物的鉴定：为检测尿素分解菌的存在与否，在以尿素为唯一氮源的__________(选择、鉴别)培养基中加入______指示剂，如果存在尿素分解菌，则指示剂将变______色。

答案

(1)有机质

接近中性

(2)氯化汞

高压蒸汽灭菌

将灭菌过的培养基在适宜的酶温度下放置一段时间，观察培养基上是否有菌落产生

(3)C6H12O6――→2C2H5OH＋2CO2

有

11

氧

(4)平板划线法

稀释涂布平板法

(5)选择

酚红

红

解析

(1)微生物主要分布在有机质丰富的土壤表层，细菌常生活在酸碱度接近中性的潮湿土壤中。(2)植物组织培养时，对外植体常用酒精和氯化汞消毒，对培养基常用高压蒸汽灭菌法灭菌；可通过在适宜的温度下放置灭菌过的培养基，看其是否有菌落产生来确定培养基灭菌是否彻底。(3)醋酸菌为需氧型生物。(4)最常用的微生物接种方法有平板划线法和稀释涂布平板法。(5)用选择培养基筛选目的菌——尿素分解菌，加入酚红指示剂，若存在尿素分解菌，指示剂将变红色。

8．一种广泛使用的除草剂(含氮有机物)在土壤中不易被降解，长期使用可污染土壤。为修复被该除草剂污染的土壤，可按下面程序选育能降解该除草剂的细菌(已知该除草剂在水中溶解度低，含一定量该除草剂的培养基不透明)。

(1)制备土壤浸出液时，为避免菌体浓度过高，需将浸出液进行稀释处理。现有一升土壤浸出液，用无菌吸管吸取1 mL液样至盛有9 mL无菌水的试管中，依次稀释10稀释度。各取0.1 mL已稀释10倍的水样分别接种到三个培养基上培养，记录的菌落数分别为55、56、57，则每升原土壤浸出液样中菌体数为________。

(2)要从长期使用该除草剂的土壤中分离目的菌，从用途方面来看，上述培养皿中培养基的特点是______________________________________________________________ ________________________________________________________________________。

(3)接种技术的核心是___________________________________________________。

在划线接种时，连续划线的目的是将聚集的菌种逐步________________________。培养时，只有很少菌落出现，大部分细菌在此培养基上不能生长的主要原因是__________________________________________________或有氧条件抑制了这些细菌的生长。

(4)在培养基上形成的菌落中，无透明带菌落利用的氮源主要是________，

有透明带菌落利用的氮源主要是__________________________________，据此可筛选出目的菌。实验结果如图显示的A～E五种菌株中，________是最理想的菌株。

(5)科研人员用放射线处理该细菌获得两个突变株A和B，然后对突变株A和B进行实验，结果如下表所示：

接种的菌种

A B A＋B 一般培养基

不生长

不生长

能生长

实验处理及结果

添加营养物质甲，能生长

添加营养物质乙，能生长

不添加营养物质甲、乙就能生长

33突变株A不能在一般培养基上生长的原因是__________________________________

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________________________________________________________________________。

突变株A和B混合在一起接种于一般培养基中能生长的最可能原因是____________ ________________________________________________________________________。

答案

(1)5.6×10

(2)在无氮固体培养基中添加了该除草剂

(3)防止杂菌污染，保证培养物的纯度

稀释获得单个菌落

培养基中缺少这些细菌可利用的氮源

(4)氮气

该除草剂

E (5)突变株A缺乏合成营养物质甲所需要的酶

突变株A生长需要营养物质甲，突变株B可以提供；突变株B生长需要营养物质乙，突变株A可以提供

解析

因该除草剂为含氮有机物，故所用培养基应是以除草剂为唯一氮源的选择培养基。接种要在酒精灯火焰旁进行，以防止杂菌污染，保证培养物的纯度。在该种选择培养基上固氮和能分解除草剂的微生物均能生长，但固氮微生物菌落周围无透明圈。E菌落周围的透明圈最大，说明该菌落中的微生物分解除草剂的能力强。

9．某化工厂的污水池中，含有一种有害的、难于降解的有机化合物A。研究人员用化合物A、磷酸盐、镁盐以及微量元素配制的培养基，成功地筛选到能高效降解化合物A的细菌(目的菌)。实验的主要步骤如下图所示。请分析回答问题：

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(1)接种前需要对培养基及培养皿等进行灭菌，常用的灭菌方法是________。培养基中加入化合物A的目的是筛选__________。

(2)实验需要振荡培养，由此推测“目的菌”的代谢类型是________。

(3)培养若干天后，应选择培养瓶中化合物A含量________的培养液，接入新的培养液中连续培养，使“目的菌”的数量__________。

(4)转为固体培养时，为获得单菌落进行继续筛选，常采用平板划线法或______________法，接种后，应将培养皿______(填“正放”或“倒置”)。

(5)下列有关平板划线操作的叙述，错误的是 B．将已冷却的接种环伸入菌液中蘸取一环液

C．蘸取菌液和划线要在火焰旁进行

D．划线时要将最后一区的划线与第一区的划线相连

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(

) A．在操作的第一步以及每次划线之前都要将接种环放在火焰上灼烧

(6)实验结束时，使用过的培养基应该进行________处理后，才能倒掉。

(7)若用水葫芦来去除该污染物，是否可行？为什么？____________________________ ________________________________________________________________________。

答案

(1)高压蒸汽灭菌法

目的菌

(2)异养需氧型

(3)减少

增加

(4)稀释涂布平板

倒置

(5)D (6)灭菌

(7)否。水葫芦会造成外来物种的入侵

解析

培养基及培养皿等常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌法；培养基中加入化合物A的目的是筛选到能降解化合物A的目的菌；振荡培养可以增加培养液中的氧含量，再依据培养液中含有有机化合物可以推出“目的菌”的代谢类型是异养需氧型；培养若干天后，应选择培养瓶中化合物A含量减少的培养液，接入新的培养液中连续培养，目的是使“目的菌”的数量增加；转为固体培养时，为获得单菌落进行继续筛选，常采用平板划线法或稀释涂布平板法，接种后，应将培养皿倒置，以防止培养皿盖上的水珠落入培养基，造成污染；利用平板划线法获得单菌落，划线时不能将最后一区的划线与第一区的划线相连，这样做不能得到单个菌落；实验结束时，使用过的培养基应该进行灭菌处理后，才能倒掉，以防止污染环境；用水葫芦来去除该污染物是不可取的，因为水葫芦会造成外来物种的入侵。

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