课题2　多聚酶链式反应扩增DNA片段国家获奖教案

课题2

多聚酶链式反应扩增DNA片段

一、多聚酶链式反应：PCR 是一种 迅速扩增 的技术，它能以极少量的DNA为模 板，在几小时内复制出上百万份的DNA拷贝。

二、PCR原理

1．在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似．细胞内参与DNA复制的各种成分和基本条件以及各自的作用如下表：

参与的组分

解旋酶

DNA母链

DNA聚合酶

引物

在DNA复制中的作用

4种脱氧核苷酸

2．DNA的方向

通常将DNA的羟基(－OH)末端称为 端，面磷酸基团的末端称为 端。

3．引物

引物是一小段 ，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。用于PCR的引物长度通常为 个核苷酸。

引物的作用：DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从引物的 端延伸DNA链，因此，DNA复制需要引物。

4．DNA的合成方向

当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3’端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的 端向 端延伸。

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5．DNA的变性与复性

在80-100℃的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链，这个过程称为复性。

6．PCR对DNA双链的解聚与结合控制

PCR利用了DNA的受热（80—100℃） 原理，通过控制温度来控制双链的解链与结合。

7．TaqDNA聚合酶的应用

PCR中的高温会导致普通DNA聚合酶失活，而耐高温的 解决了这个问题，大大增加了PCR的效率，使PCR技术趋向自动化。

8．PCR扩增DNA的基本条件

PCR反应需要在一定的缓冲溶液中提供： 模板，分别与两条模板链相结合的 种 。四种 ， ，同时通过控制 使DNA复制在体外反复进行。

三、PCR的反应过程

1．PCR一般要经历 次循环，每次循环可以分为 、

和 三步。

2．在循环之前，常要进行一次 。

3．从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为 参与反应，并且由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ ，进行DNA的延伸。这样，DNA聚合酶只能特异地复制处于 的DNA序列，使这段固定长度的序列呈 扩增。

四、实验操作

1．做PCR通常使用 ，它是一种薄壁塑料管，总容积为0.5mL。具体操作时，用微量移液器向微量离心管中依次加入各组分，再设计好PCR仪的循环程序就可以了。

2．如果没有PCR仪，可以设置3个恒温水浴锅，温度分别为 ℃、 ℃和 ℃，然后按照上表的要求，在3个水浴锅中来回转移PCR反应的微量离心管即可。

3．PCR的突出优点是快速、高效、灵活和易于操作。

预变性

30次

最后一次

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变性

复性

——

延伸

——

五、DNA含量的测定

DNA在

的紫外线波段有一强烈的吸收峰(见下图)。可以利用DNA的这一特点进行DNA含量的测定。具体步骤如下：

1．将样品进行

倍稀释：取2LPCR反应液，加入98L蒸馏水。

2．以蒸馏水作为

，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零。

3．加入步骤1中的DNA稀释液100L至比色杯中，测定260nm处的光吸收值。

4．计算DNA含量：

六、实验注意事项

1．为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行 。

2．PCR所用的缓冲液和酶要分装成 ，并在 下储存。

3．在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须 。所有的成分都加入后，盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管的侧壁，使反应液 ，再将微量离心管放在离心机上，离心约10s，使反应液集中在离心管 ，再放入PCR仪中进行反应。

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课堂练习：

1．

在（

）的温度范围内，DNA的双螺旋结构解开

A. 10－20℃

B. 80－100℃

C. 20－30℃

D. 40－60℃

2．

关于DNA的复制，下列叙述正确的是

A.

DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从5’端延伸DNA链

B.

DNA复制不需要引物

C.

引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合

D.

DNA的合成方向总是从子链的3’端向5’端延伸

3．

下列有关PCR描述，不正确的是

A.

是一种酶促反应

B.

引物决定了扩增的特异性

C.

扩增产量按y＝（1＋X）n

D.

扩增对象是氨基酸序列

E.

扩增对象是DNA序列

4．（1）PCR反应需要的条件：缓冲溶液、DNA模板、引物、四种脱氧核苷酸、耐热的DNA聚合酶，为什么？

（2）在PCR反应中与解旋酶作用相同的操作是：________。

5．

空难之后对面目全非的航天员遗体残骸辨认可借助DNA杂交技术。该技术是从尸体和死者家属提供的死者生前的生活用品中分别提取DNA，在一定温度下水浴共热，使DNA的氢键断裂，双链打开。若两份DNA样本来自同一个体，在温度降低时，两份样本中的DNA单链会通过氢键连接在一起；反之，则不能互补。已知某DNA单链碱基组成为ATCCGAT，则与它互补的另一条单链组成为________，为保证准确性，需用较多的DNA样品，这可以通过一定的技术使DNA分子大量复制，若一个DNA分子中，腺嘌呤含量为15％，复制所用的原料均为3H标记的脱氧核苷酸，经四次复制后，不含3H的DNA单链占全部单链的________，子代DNA分子中胞嘧啶的比例为________。

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