课题2　多聚酶链式反应扩增DNA片段优质课教案设计

多聚酶链式反应扩增DNA片断

课题目标

本课题通过尝试PCR(DNA多聚酶链式反应)技术的基本操作,使学生体验PCR这一常规的分子生物学实验方法,理解PCR的原理,讨论PCR的应用。

课题重点

PCR的原理和PCR的基本操作。

课题难点

PCR的原理。

课时安排

1课时

教学方法

讲授法、讨论法

教学过程

一、

复习导入

多聚酶链式反应，又叫PCR，本质上是一种在体外模拟细胞内DNA分子复制过程的技术。可广泛应用于遗传病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等。要学习PCR，先复习DNA体内复制的要点内容。

二、

讲授新课

（一）基础知识

1、DNA分子的结构

（1）元素组成：C、H、O、N、P （2）基本单位：脱氧核苷酸

（3）脱氧核苷酸链的形成：3’，5’-磷酸二酯键

（4）DNA的空间结构：双螺旋结构

2、DNA的复制

基本条件：

酶:解旋酶、DNA聚合酶

能量:ATP 原料:四种脱氧核苷酸

模板:DNA的两条链

（二）多聚酶链式反应（PCR）

1、PCR的原理

（1）变性与复性

在80－100°C的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链。

（2）Taq DNA聚合酶的应用

（3）需要为PCR反应提供的条件

缓冲溶液，DNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的DNA聚合酶，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。

2、PCR的反应过程：

⑴.变性（模板DNA解旋）

0模板DNA经加热至90C以上。一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备。

⑵.复性（退火）

0模板DNA经加热变性成单链后，温度降到50C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。

⑶.延伸

072C 左右DNA模板－引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板，按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的DNA链。

（三）PCR实验操作

1、设备及用具

（1）PCR仪

PCR仪实际上就是一台能够自动调控温度的仪器，它可以根据DNA的热变性原理，通过自动改变温度，达到扩增DNA片段的目的。

（2）微量离心管

一种薄壁塑料管，总容积为0.5mL （3）微量移液器

用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次

（4）离心机

一种通过高速转动产生离心现象，能将固体与液体分开的设备。

2、实验操作步骤

（1）准备：按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上。

（2）移液：用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂。

（3）混合：混合后盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁。

（4）离心：微量离心管放在离心机上,离心约10s。使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果。

（5）反应：将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序。

PCR一般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤──变性、复性和延伸. 3、注意事项：

PCR技术高度灵敏，为了避免外源DNA等因素的污染而造成干扰实验，PCR操作时要注意做到：

⑴

隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌；

⑵分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头

4、PCR技术的特点：

PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、

简便、重复性好、易自动化等特点。

最突出的优点是快速、高效、灵活、易于操作

（四）课题成果评价

1、理论上DNA扩增数目的计算

n（1）一条DNA，复制n次， DNA为2

n（2）a条DNA，复制n次， DNA为a x2

2、实验中DNA含量的测定

（1）原理

可以通过测量DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关

（2）过程

①稀释

2µL PCR反应液，加入98µL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释

②对照调零

以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零

③测定并计算

取DNA稀释液100µL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值

DNA含量（g/mL）＝50×(260nm的读数)×稀释倍数

50：在厚度为1cm比色杯中的吸光值为1, DNA 的含量为50g /mL 三、

课堂小结

四、

课堂练习

五、

作业