课题3　分解纤维素的微生物的分离教案和学案内容

第三节：分解纤维素的微生物的分离(教案)

一.纤维素与纤维素酶

培养基组分

纤维素粉

NaNO3

Na2HPO4·7H2O

KH2PO4

MgSO4·7H2O

KCl

酵母膏

含量

5 g

1 g

1.2 g

0.9 g

0.5 g

0.5 g

0.5 g

0.5 g

将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到

1 000 mL

提供的主要营养

碳源

氮源、无机盐

无机盐

1.纤维素：

(1)组成：纤维素由

C、H、O 三种元素组成，单体是葡萄糖，分子通式为(C6H10O5)n，是地球上含量最丰富的多糖类物

质。

(2)分布：棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物，此外，木材、亚麻、作物秸秆等也富含纤维素。

生长因子、碳源、氮源

氮源、生长因子

水解酪素

(3)种类：除天然纤维素外，还有水溶性的羧甲基纤维素钠、不溶于水的微晶纤维素等。

(4)性质：纤维素为白色、无气味的纤维状结构物质，不溶于水，也不溶于一般有机溶剂。与淀粉一样，纤维素不具有

还原性，但其水解产物葡萄糖具有还原性。

(5)用途：纤维素可用于造纸、纺织、制造炸药等；食物中的膳食纤维具有刺激胃肠蠕动、促进消化液分泌的功能，被

称为第七营养素。

2.纤维素酶：

(1)组分：纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即

C1 酶、Cx 酶和葡萄糖苷酶。

葡萄糖苷酶

C1酶、Cx酶

(2)作用：纤维素―――――――→纤维二糖――――――→葡萄糖

(2)鉴别纤维素分解菌的鉴别培养基(固体培养基)，在该培养基中加入刚果红溶液，在该培养基上生长的纤维素分解菌分 泌纤维素酶，因此菌落周围会形成透明圈。

培养基组分

CMC－Na

酵母膏

KH2PO4

含量

5～10 g

1 g

0.25 g

15 g

100 mL

将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到

1 000 mL 提供的主要营养

碳源

碳源、氮源、生长因子

无机盐

凝固剂

碳源、生长因子

琼脂

土豆汁

(3)实验验证纤维素酶的作用：

试管

1

2

结论

纤维素酶

(70～80U/mL)

1 mL

/

条件

将两支试管固定在

50 mL 的锥形瓶中，在

摇床上以

140 r/min 的转速振荡反应

1 h 结果

完全分解

基本无变化

滤纸条

1 cm×6 cm 1 cm×6 cm 缓冲液

pH＝4.8

10 mL

11 mL

3.筛选方法：刚果红(CR)染色法

项目

内容

方法一

(先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应)

培养基上长出菌落→覆盖质量浓度为

1 mg/mL 的

CR 方法二

(在倒平板时就加入刚果红)

纤维素酶能分解纤维素

过程

备注：除自然环境中存在分解纤维素的微生物外，在草食动物牛、马、羊等的消化道内，也共生有分解纤维素的微生物，

其可产生纤维素酶分解纤维素，而人体没有分解纤维素的能力。

二.纤维素分解菌的筛选

1.筛选原理：

10～15 min

溶液

CR 溶液→加入物质的量浓度为―――――→倒去

1mol/L NaCl 溶液――→倒掉

NaCl 溶液→出现透明圈

优点

15 min

配制质量浓度为

10 mg/mL 的

CR 溶液→灭菌→按

照

1 mL CR/200 mL

培养基比例混匀→倒平板→培

养→出现透明圈

显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用，鉴

操作简便，不存在菌落混杂问题

定明确

纤维分解菌纤维霉素

①由于琼脂、土豆汁中均含有淀粉类物质，可能

使产生淀粉酶的微生物也形成透明圈，即假阳性

缺点

制作繁琐，加入刚果红会使菌落之间发生混杂

反应；②有些微生物具有降解色素的能力，它们

会降解刚果红形成透明圈，与纤维素分解菌不易

区分

备注：方法一中加入

NaCl 溶液的作用：洗去未和纤维素结合的刚果红染液，留下大大小小的透明圈(大的透明圈说明纤

刚果红红色复合物――――→红色消失，出现透明圈

纤维素即：刚果红可以与像纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。在含

有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后，刚果

红——纤维素的红色复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，因此，可以通过是否产生透

明圈来筛选纤维素分解菌。

2.培养基

(1)纤维素分解菌的选择培养基或称为富集培养基(液体培养基)，该培养基中富含的碳源为纤维素粉，而不是以纤维素为

唯一碳源的培养基，所以在培养过程中除得到大量的纤维素分解菌外，也有其他微生物的存在，但只有以纤维素为碳源

的微生物才能大量繁殖，因此纤维素分解菌占优势地位；该选择培养基的目的是：利用这种培养基可以增加纤维素分解

菌的浓度，以确保能从样品中分离到所需要的微生物。

维素分解菌分解纤维素能力强) 4.筛选流程：

(1)实验流程：

土壤取样→选择培养(这一步可以省略)→梯度稀释→涂布培养→挑选菌落

(2)具体操作：

①土壤取样：选择富含纤维素的环境，用无菌的小铁铲铲去表层土，迅速铲取土壤装入无菌信封，密封。(备注：采集

土样时，选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等。还可以将富含纤维素的物

质，如滤纸等，埋在土壤中，经过

30d 左右，再从已腐烂的滤纸上筛选纤维素分解菌) ②选择培养(或富集培养或扩大培养)：

★配置选择培养基：目的是增加纤维素分解菌的浓度，以确保能从样品中分离到所需要的微生物。

无菌条件下

★操作过程：称取土样 20 g――――――→加入装有

30 mL 选择培养基的锥形瓶中―――――→

将锥形瓶固定在摇床上

30℃下振荡培养1~2d

――――――――――→培养液变混浊―――→吸取一定量的培养液(如

5 mL)―――→转移至另一瓶新鲜的选择培养基中―――→

思考

1：草食性动物是怎样消化食物中的纤维素的？

提示：反刍动物的瘤胃中生活着大量的可以分解纤维素的微生物。微生物能够产生纤维素酶，最终将纤维素分解成葡萄

糖。

思考

2：培养基中出现透明圈一定是纤维素分解菌的作用吗？

提示：不一定。刚果红与多糖类化合物产生红色复合物，若多糖为淀粉，产生淀粉酶的微生物也可使培养基产生透明圈。

思考

3：为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？

提示：由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对较高，因此从这种环境中获

得目的微生物的概率要高于普通环境。

思考

4：在纤维素分解菌的筛选过程中涉及到的生物技术有哪些？

提示：主要用到培养基的配制、无菌操作技术、稀释涂布平板法、选择培养基的作用和土壤取样等。

摇床上振荡培养―――→培养液变混浊

③梯度稀释：用移液管从选择培养基中吸取

1mL 培养液，注入盛有

9mL 无菌水的试管中，吹吸三次，使充分混匀；用

移液管从此试管中吸取

1mL 菌液注入另一支盛有

9mL 无菌水的试管中，依次类推，分别配置成

101、102、103、104、

105、106 倍的各种稀释液，并做好标记。

④涂布培养：

★配置鉴别培养基：目的是初步对纤维素分解菌进行鉴定

★操作过程：将稀释液用涂布器涂布到已经制备好的鉴别纤维素分解菌的培养基上，将平板倒置于

30~37℃的恒温箱中

培养

1~2d，每隔

24h 观察菌落的生长情况。

⑤挑选菌落：通过刚果红染色法，挑选产生透明圈的菌落。

备注：

★在实验操作中，土壤取样、选择培养、梯度稀释、涂布培养步骤都必须注意无菌操作。

★纤维素分解菌的纤维素酶位于细胞膜上，分解纤维素时需要附着在纤维素上，而真菌、放线菌的纤维素酶是胞外酶，

能分泌到培养基中，可以通过过滤、离心获得真菌、放线菌中的纤维素酶。

★酶活力=透明圈直径/菌落直径

5.结果分析与评价：

①取样：适于纤维素分解菌繁殖的富含纤维素的环境中会有较多的纤维素分解菌。

②选择培养基是否筛选出菌落：在实验组培养基上，如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能(因为形成透明圈的菌

落与其他微生物菌落可能出现混杂现象，而且产生透明圈的菌落可能是产生淀粉酶的微生物，也可能是降解刚果红的菌

种)获得了纤维素的微生物。

③分离结果的一致性：由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌，因此最容易分离得到的是细菌。但由于取土样

的环境不同，还可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。

6.纤维素分解菌的进一步鉴定：

对通过刚果红染色法分离得到的纤维素分解菌需进行进一步发酵产纤维素酶的实验来鉴定，其原因是形成的菌落可能与

其他菌落混杂，产生透明圈的菌落可能是产生淀粉酶的微生物形成的，还可能是降解刚果红的菌种形成的，因此需进一

步鉴定。

(1)鉴定原理：

通过微生物发酵，看能否产生纤维素酶。发酵的方法分为固体发酵和液体发酵。若发酵产物中有纤维素酶，则菌种是纤

维素分解菌。

(2)纤维素酶的鉴定方法：

通过鉴定纤维素酶水解纤维素产生的葡萄糖，来鉴定纤维素酶的产生。葡萄糖与斐林试剂在

50~65℃水浴条件下共热

1~2min，可形成砖红色沉淀，以此判断微生物是否产生了纤维素酶。