复习与测试板书设计及设计说明

微生物的培养与应用复习与测试

教材分析：

“微生物的实验室培养”是研究和应用微生物的前提，其基本操作技术是生物科学、医学等领域最基本的实验技术，也是高中生必须掌握的实验操作技术。“微生物的实验室培养”是选修1的专题2“微生物的培养与应用”中的第1个课题，旨在为学生实践其他的生物技术实验做好铺垫，又由于本节内容位于传统的发酵技术之后，所以它是在传统的生物实践技术的基础上发展起来的，同时又为微生物的应用奠定了基础，因此，可用“承前启后”这个词语来概括本课题的地位。

教学重点：无菌技术的操作

教学难点：

无菌技术的操作

教学过程

导入在传统发酵技术的应用中，都利用了微生物的发酵作用，其中的微生物来自于制作过程中的自然感染。而在工业化生产中，为了提高发酵的质量，需要获得优良菌种，并保持发酵菌种的纯度。这就要涉及到微生物的培养、分离、鉴别等基本技术。现在我们开始学习微生物的培养和应用专题

微生物培养关键是1、提供营养和条件，2、防止污染

一、培养基

1、培养基的种类包括

固体

培养基和

液体

培养基等。

标准

物理性质

培养基类型

固体培养基

半固体培养基

液体培养基

合成培养基

天然培养基

鉴别培养基

选择培养基

配制特点

加入琼脂较多

加入琼脂较少

不加入琼脂

由已知成分配制而成，培养基成分明确

由天然成分配制而成，培养基成分不明确

添加某种指示剂或化学药剂

添加（或缺少）某种化学成分

主要应用

菌种分离,鉴定,计数

菌种保存

工业生产，连续培养

菌种分类、鉴定

工业生，产降低成本

菌种的鉴别

菌种的分离

思考：

硝化细菌的氮源、固氮生物的氮源、自养生物的碳源、异养生物的碳源分别是什么？

琼脂是从红藻中提取的

多糖

，在配制培养基中用作为

凝固剂

。

化学组成

目的用途

2、培养基的化学成分包括

水

、

无机盐

、

碳源

、

氮源

四类营养成分。

碳源：如CO2、糖类、脂肪酸等有机物，构成微生物的结构物质和分泌物，并提供能量。

氮源：如N2、氨盐、硝酸盐、牛肉膏、蛋白胨等，主要用来合成蛋白质、核酸及含氮代谢物等。含有C、H、O、N的化合物既可以作为碳源，又可以

作为氮源，如氨基酸等。

3、微生物生长条件：

培养基除满足微生物生长的

pH 、

特殊营养物质

和

氧气

等要求。

特殊营养物质：某些微生物正常生长代谢过程中必须从培养基中吸收的微量有机小分子，如某些氨基酸、碱基、维生素等。

培养乳酸杆菌时需要添加

维生素

，培养霉菌时需要将培养基pH调节为

酸性

，培养细菌时需要将pH调节为

中性或微碱性

。

二、无菌技术

获得纯净培养物的关键是

防止外来杂菌的入侵

。

1、无菌操作包括：

（1）对实验操作空间、操作者的衣着和手进行

清洁和消毒

；

（2）将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行

灭菌

；

（3）为避免周围微生物污染，实验操作应在

酒精灯火焰附近

旁进行；

（4）避免已灭菌处理的材料用具与

周围物品

相接触。

2、消毒方法：

煮沸消毒；化学药物消毒；紫外线消毒。

（1）日常生活经常用到的是

煮沸

消毒法；

（2）对一些不耐高温的液体，则使用

巴氏

消毒法（作简要介绍）；

（3）对接种室、接种箱或超净工作台首先喷洒

石炭酸或煤酚皂

等溶液以增强消毒效果，然后使用

紫外线

进行物理消毒。

（4）实验操作者的双手使用

酒精

进行消毒；

（5）饮水水源用

氯气

进行消毒。

3、灭菌方法：

（1）接种环、接种针、试管口等使用

灼烧

灭菌法；

（2）玻璃器皿、金属用具等使用

干热

灭菌法，所用器械是

干热灭菌箱

；

（3）培养基、无菌水等使用

高压蒸汽

灭菌法，所用器械是

高压蒸汽灭菌锅

。

（4）表面灭菌和空气灭菌等使用

紫外线

灭菌法，所用器械是

紫外灯

。

4、消毒和灭菌比较（填表）

比较项

消毒

灭菌

理化因素的作用强度

较为温和

强烈

消灭微生物的数量

部分生活状态的微生物

全部微生物

芽孢和孢子能否被消灭

不能

能

思考：物品装入高压蒸汽灭菌锅灭菌后，要首先打开排气阀，煮沸并排除锅内冷空气，其目的是

有利于锅内温度升高

；随后关闭排气阀继续加热，气压升至

100k Pa，温度为

121℃

，并维持

15～30 min；最后切断热源，使温度自然降温，气压务必降至

零

时打开锅盖，其目的是防止

容器中的液体暴沸

。

思考：无菌技术除了防止培养物被污染外，还具有的目的是

防止感染实验操作者

。

三、实验操作

一）、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基

计算 →

称量 → 融化

→

调pH → 灭菌 → 倒平板

1、计算：根据配方比例，计算100mL培养基各成分用量。

2、称量：准确称取各成分。称取牛肉膏和蛋白胨时动作要迅速，目的是防止牛肉膏吸收空气中水分。

3、溶化：①加水加热熔化牛肉膏；②加入蛋白胨和氯化钠继续加热；③加入琼脂；④用蒸馏水定容到100mL。整个过程不断用玻棒搅拌，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。

4、调pH：用1mol/LNaOH溶液调节pH至偏碱性。

5、灭菌：将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加塞包扎后用高压蒸汽灭菌锅灭菌；所用培养皿用报纸包扎后用干热灭菌箱灭菌。

6 、倒平板：待培养基冷却至50℃左右时在酒精灯火焰附近操作进行。

其过程是：

①在火焰旁右手拿锥形瓶，左手拔出棉塞；

②右手拿锥形瓶，使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰；

③左手将培养皿打开一条缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖。

④待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置。

〖思考1〗锥形瓶的瓶口通过火焰的目的是消灭瓶口的杂菌，防止杂菌感染培养基。

思考：

①

皿底和皿盖的大小关系？培养基是倒在那个上面？

②“倒平板”中的“倒”字该如何理解？

③培养基和培养皿的灭菌方法有何不同？为什么？

④“倒平板”指的是接种前还是接种后，还是都要？

〖思考2〗倒平板的目的是防止培养基冷却过程中形成的水滴落到培养基表面。

〖思考3〗若皿盖和皿底之间粘有培养基，则该平板能否培养微生物？为什么？

不能。空气中杂菌会在这些粘附培养基上繁殖，并污染皿内培养基。

〖思考4〗配制斜面培养基中，试管要加塞棉塞的目的是保持通气并防止杂菌感染。

〖思考5〗试管培养基形成斜面的作用是增大接种面积。

思考：①科学研究为什么常用菌落作为培二）、纯化大肠杆菌

养和分离微生物的主要依据？

微生物接种的最常用方法是平板划线法和稀释涂布法，

②菌落形成常在什么培养基表面？液体培原理是：通过连续划线或系列稀释，降低大肠杆菌浓度，养基可以产生菌落吗？

得到单个细菌繁殖成的菌落。

③为什么说获得单个菌落就表示微生物得1、平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续到了“纯化”？

④菌落的观察主要从哪些方面进行？

划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。

其操作步骤是：

①将接种环在酒精灯火焰上灼烧直至烧红。

②在酒精灯火焰旁冷却接种环，并打开大肠杆菌的菌种试管的棉塞。

③将菌种试管口通过火焰达到消灭试管口杂菌的目的。

④将冷却的接种环伸入到菌液中取出一环菌种。

⑤将菌种试管口再次通过火焰后塞上棉塞。

⑥将皿盖打开一条缝隙，把接种环伸入平板内划3～5条平行线，盖上皿盖，不要划破培养基。

⑦灼烧接种环，冷却后从第一区划线末端开始向第二区域内划线。重复上述过程，完成三、四、五区域内划线。注意不要将第五区的划线与第一区划线相连。

⑧将平板倒置放在培养箱中培养。

〖思考6〗取菌种前灼烧接种环的目的是消灭接种环上的微生物；除第一次划线外，其余划线前都要灼烧接种环的目的是消灭接种环上残留菌种；取菌种和划线前都要求接种环冷却后进行，其目的是防止高温杀死菌种；最后灼烧接种环的目的是防止细菌污染环境和操作者。

〖思考7〗在第1次划线后都从上次划线末端开始的目的是获得由单个细菌形成的标准菌落。

2、稀释涂布平板法：将菌液进行一系列梯度稀释，并将不同稀释度菌液分别涂布到琼脂固体培养基上进行培养。当稀释倍数足够高时，即可获得单个细菌形成的标准菌落。

系列稀释操作：

①取盛有9mL水的无菌试管6支，编号101、102、103、104、105、106。

②用灼烧冷却的移液管吸取1mL菌液注入编号为101试管中，并吹打3次，使之混匀。

③从101倍液中吸取1mL菌液注入到编号为102试管内吹打均匀，获得102倍液。依此类推。

平板涂布

将不同稀释度的菌液分别用涂布器涂布在琼脂固体培养基表面

，进行培养。当稀释倍数足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。

3、平板划线法和稀释涂布平板法的比较

平板划线

分离法

优点

可以观察菌落特征，对混合菌进行分离

缺点

不能计数

适用范围

适用于好氧菌

稀释涂布

平板法

4、培养观察

吸收量较少、可以计数，可以观察较麻烦，平板不干适用于厌氧菌菌落特征

燥效果不好，容易和兼性厌氧菌

蔓延

将接种后的培养基和一个未接种的培养基都放入37℃恒温箱中，培养 12h和24h为观察基点比较合适，因为微生物具有繁殖快的特点，如思考：在某培养基果培养时间太长，菌落也会连成一片，就不容易看到单个菌落了。

上出现了3种特征不5、结果分析与评价

同的菌落，原因有培养基灭菌不彻底或杂菌1）

培养未接种培养基的作用是对照，若有菌落形成，说明感染等。

培养基灭菌不彻底。

2）

在肉汤培养基上，大肠杆菌菌落呈白色，为圆形，光滑有光泽，边缘整齐。

3）

培养12h和24h后的菌落大小不同（相同、不同）；菌落分布位置相同（相同、不同）。原因是时间越长，菌落中细菌繁殖越多，菌落体积越大；菌落的位置不动，但菌落数增多。

三、菌种保藏

1、临时保藏：频繁使用的菌种利用临时保藏法保存，利用固体斜面培养基培养后，保存在4℃冰箱中，每3～6个月转种培养一次，缺点是保存时间较短，容易发生污染和变异；

2、长期保存菌种的方法是甘油管藏法。后者将菌种与无菌体积等量混合后保存在－20℃冷冻箱中。

及时训练

例1．关微生物营养物质的叙述中，正确的是

A.是碳源的物质不可能同时是氮源

B.凡碳源都提供能量

C.除水以外的无机物只提供无机盐

D.无机氮源也能提供能量

解析：不同的微生物，所需营养物质有较大差别，要针对微生物的具体情况分析。对于A、B选项，它的表达是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同时是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同时是能源，如葡萄糖；有的碳源同时是氮源，也是能源，如蛋白胨。对于C选项，除水以外的无机物种类繁多，功能也多样。如二氧化碳，可作为自养型微生物的碳源；NaHC O3，可作为自养型微生物的碳源和无机盐；而NaCl则只能提供无机盐。对于D选项，无机氮源提供能量的情况还是存在的，如NH3可为硝化细菌提供能量和氮源。

答案：D 例2．下面对发酵工程中灭菌的理解不正确的是

A.防止杂菌污染

B.消灭杂菌

C.培养基和发酵设备都必须灭菌

D.灭菌必须在接种前

解析：灭菌是微生物发酵过程的一个重要环节。A说的是灭菌的目的，因为发酵所用的菌种大多是单一的纯种，整个发酵过程不能混入其他微生物（杂菌），所以是正确的；B是错误的，因为灭菌的目的是防止杂菌污染，但实际操作中不可能只消灭杂菌，而是消灭全部微生物。C是正确的，因为与发酵有关的所有设备和物质都要灭菌；发酵所用的微生物是灭菌后专门接种的，灭菌必须在接种前，如果接种后再灭菌就会把所接菌种也杀死。

答案：B 例3．右表是某微生物培养基成分，请据此回答：

（1）右表培养基可培养的微生物类型是

。

（2）若不慎将过量NaCl加入培养基中。如不想浪费此培养基，可再加入

，用于培养

。

（3）若除去成分②，加入（CH2O），该培养基可用于培养

。

编号

①

②

③

④

成分

粉状硫

（NH4）2SO4

K2HPO4

MgSO4

FeSO4

CaCl2

H2O 含量

10g 0.4g 4.0g 9.25g 0.5g 0.5g 100ml （4）表中营养成分共有

类。

⑤

（5）不论何种培养基，在各种成分都溶化后分装前，要进行的是

。

（6）右表中各成分重量确定的原则是

。

⑥

⑦

（7）若右表培养基用于菌种鉴定，应该增加的成分是

。

解析：对于一个培养基，它能培养何种微生物，要看它的化学成分。当然这只适用于合成培养基，如果是一个天然培养基就不能从培养基的成分上区分它是培养何种微生物的。分析化学成分要从营养物质的类型出发。右表中的营养物质有水、无机盐、氮源三类，缺乏碳源和特殊营养物质。对特殊营养物质，有的微生物是不需要的，但没有微生物是不需要碳源的。该培养基中没有碳源，说明培养的微生物是从空气中获得碳源的，即可培养的微生物就是自养型微生物了。该培养基中加入了过量食盐，就可以成为金黄色葡萄球菌鉴别培养基，但金黄色葡萄球菌是异养型微生物，这个培养基就还需要加入有机碳源。该培养基若加入（CH2O），培养基中就有了碳源，但除去成分②，却使培养基中没有了氮源，这时就只能用于培养固氮微生物了。对于菌种鉴定，往往用的是固体培养基，而表中没有凝固剂，需要加入常见的凝固剂——琼脂。

答案：⑴自养型微生物

⑵含碳有机物

金黄色葡萄球菌

⑶固氮微生物

⑷3

⑸调整pH

⑹依微生物的生长需要确定

⑺琼脂（或凝固剂）

4（2009·宁夏理综，40）

（1）在大肠杆菌培养过程中，除考虑营养条件外，还要考虑

、

和渗透压等条件。

（2）在微生物培养操作过程中，为防止杂菌污染，需对培养基和培养皿进行 处理（消毒、灭菌），其中对培养皿进行灭菌常用的方法是

；操作者的双手需要进行清洗

。

（3）若用稀释涂布平板法计数大肠杆菌活菌的个数，要想使所得估计值更接近实际值，除应严格操作、多次重复外，还应保证待测样品稀释的

。

（4）通常，对获得的纯菌种还可以依据菌落的形状、大小等菌落特征对细菌进行初步的

。

（5）培养大肠杆菌时，在接种前需要检测培养基是否被污染。对于固体培养基应采用的检测方法是

。

（6）若用大肠杆菌进行实验，使用过的培养基及其培养物必须经过

处理后才能丢弃，以防止培养物的扩散。

答案（1）PH 温度（2）灭菌 干热灭菌 消毒（3）比例合适（4）鉴定（5）将未接种的培养基在适宜温度下放置适宜的时间，观察培养基上是否有菌落产生（6）灭菌

5、（2010年重庆理综）炭疽病是由炭疽杆菌引起的一种人畜共患传染病。炭疽杆菌两端截平、呈竹节状排列，菌落呈卷发状。对炭疽病疑似患者，可根据噬菌体的宿主专一性，通过实验确诊。

（1）细菌培养：采集疑似患者的样本，分离培养，获得可疑菌落。

（2）细菌鉴定：实验流程如下图所示。

①对配制的液体培养基等需采取

方法灭菌；实验所用液体培养基的碳源为

（填“无机碳”或“有机碳”）。

②挑选可疑菌落制片后，用

观察，可看到呈竹节状排列的杆菌。

③接种可疑菌后，35℃培养24小时，液体培养基变浑浊，原因是 。对照组试管中应加入 ，与实验组同时培养6小时后，若实验组液体培养基的浑浊度比对照组 （填“高”或“低”），则可明确疑似患者被炭疽杆菌感染；反之则排除。

④对排除的疑似患者及易感人群，可接种炭疽杆菌疫苗，刺激机体产生相应抗体，与产生抗体相关的细胞除T细胞、B细胞外，还有 。

答案

①高压蒸汽 有机碳 ②显微镜 ③细菌大量繁殖 等量生理盐水 低 ④吞噬细胞、浆细胞