课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数教案1

土壤中分解尿素的细菌的分离与计数教学设计

教学目标：1.了解尿素的作用原理及能被细菌分解的原因。

2.理解并掌握筛选菌落和统计菌落数目的方法及对照实验的设计方法。

3.掌握土壤微生物的取样、稀释、培养和观察。

4.掌握尿素分解菌的鉴定方法。

重点难点：1.研究培养基对微生物的选择作用，进行微生物数量的测定。

2.能利用选择培养基分离细菌，运用相关技术解决生产生活中有关微生物的计数问题。

教学过程：

一研究思路

(一)

筛选菌株

(1)实例：DNA多聚酶链式反应(PCR)是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温(93 ℃左右)的________________。

1966年美国微生物学家布鲁克在美国黄石国家公园的一个热泉中发现了水生耐热细菌Taq，从该细菌中分离得到了耐高温的TaqDNA聚合酶。

(2)原因：因为热泉温度70～80 ℃，淘汰了绝大多数微生物，而使_________被筛选出来。

(3)启示：寻找目的菌种时要根据它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找。

(4)实验室中微生物的筛选原理：人为提供有利于____________生长的条件(包括营养、温度、________等)，同时________或________其他微生物生长。

(5)选择培养基：在微生物学中，将允许________种类的微生物生长，同时________或________其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。

(6)下面是本课题使用的培养基的配方，请分析：

KH2PO4

1.4 g Na2HPO4

2.1 g MgSO4·7H2O 0.2 g 葡萄糖

10.0 g 1.0 g 尿素

15.0 g 琼脂

将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL

①从物理性质看此培养基属于________培养基，是由于加入了凝固剂________。

②从功能上看属于________培养基，此培养基的________只有尿素，能利用尿素的微生物可分泌脲酶，因此能在此培养基上生长，此培养基属于________培养基。

（二）.统计菌落数目

常用来统计样品中活菌数目的方法是________________________。

(1)统计菌落数目

①稀释：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的___________。

②计数：一般选择菌落数在________的平板进行计数。

③统计：通过统计平板上的____________，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为使结果接近真实值，可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。

(2)活菌数的计算方法：每克样品中的菌株数＝

(________÷_________)×____________。

(3)统计菌落数目：关键是恰当的____________。一般以三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌落数在50个左右为最好。

(4)统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，这是因为__________________________。因此，统计结果一般用____________来表示。

（三）设置对照

(1)教材中两位同学的统计结果中，第________位同学的结果接近真实值。实验需要改进的操作是第一位同学需________________________________；第二位同学统计的三个菌落数________________，说明______________，需________________。

(2)设置对照的主要目的是排除实验组中____________因素对实验结果的影响，提高实验结果的____________。设置对照的方法：①空白对照：不给对照组任何处理因素；②条件对照：给对照组施以部分实验因素，但不是所要研究的处理因素；③自身对照：对照组和实验组都在同一研究对象上进行；④相互对照：不单设对照组，而是几个实验组相互对照。

(3)教材提供的案例中A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。一是由于土样不同，二是由于培养基污染或操作失误。如何设置对照实验来确定原因？

归纳提炼

1.选择培养基

(1)选择培养基的含义：在培养基中加入某种化学物质，以抑制不需要的微生物的生长，促进需要的微生物的生长。目的是从众多微生物中分离出所需要的微生物。

(2)常见的选择培养基

①加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。

②加入高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌。

③无氮源培养基可以分离固氮微生物。

④石油是唯一碳源的培养基，可以分离能消除石油污染的微生物。

⑤将培养基放在高温环境中培养，分离耐高温的微生物。

2.用稀释涂布平板法对微生物进行计数时的注意事项

(1)为了保证结果准确，一般设置3～5个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取其平均值。

(2)统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。

[活学活用] 1.在缺乏氮源的培养基上，大部分微生物无法生长；在培养基中加入青霉素可以抑制细菌和放线菌的生长；在培养基中加入10%的酚可以抑制细菌和霉菌的生长。利用上述选择培养基依次能从混杂的微生物群体中分离出(

) A.乳酸菌、金黄色葡萄球菌、放线菌

B.固氮细菌、大肠杆菌、放线菌

C.固氮细菌、霉菌、放线菌

D.固氮细菌、金黄色葡萄球菌、放线菌

[问题导析]

缺乏氮源的培养基，只有________菌能够生长；加入青霉素可以抑制细菌和放线菌的生长，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌都是________，不能生长；培养基中加入10%的酚可以抑制细菌和霉菌的生长，放线菌能够生长。

2.用稀释涂布平板法来统计样品中活菌的数目。在某稀释浓度下某同学做了若干个平板并统计每个平板的菌落数，最接近样品中菌体数真实值的是(

) A.菌落数量最多的平板

B.菌落数量最少的平板

C.菌落数量适中的平板

D.取若干个平板菌落数量的平均值

[问题导析]

(1)为了保证结果准确，一般选择菌落数在________的平板进行计数。

(2)为使结果接近真实值，需取多个平板培养计算出菌落__________。

二

实验设计与操作

1.下面是土壤中尿素分解菌的分离与计数的实验流程示意图，请结合教材提供的资料分析：

1.实验设计和操作提示

步骤

实验操作

操作提示

①取样用的小铁铲和盛土样的信封都要经过________；

②土壤中的微生物主要分布在距地表______的近中性土壤中，约_____为细菌

牛肉膏蛋白胨培养基可以作为________，用来判断选择培养基是否起到了________作用

①应在________旁称取土样；

②由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围________倍的稀释液；

③实验时要对所用的平板、试管作好________。如培养皿要注明培养基类型、培养时间、____________、培养物等

土壤取样

从酸碱度接近_______的_______土壤中取样。先铲去表层土_____左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中

分别配制牛肉膏蛋白胨培养基和________为唯一氮源的________培养基

①称取________ g土样加到盛有______ mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀；

②吸取上清液______ mL，转移至盛有________mL的生理盐水的无菌大试管中，按照上图流程进行样品的稀释；

③按照由107～103稀释度的顺序分别吸取_____ mL进行______操作。按照浓度从____到____的顺序涂布平板，不必更换移液管

将涂布好的培养皿放在____ ℃温度下培养。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。比较牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录

制备

培养基

样品的

稀释和

涂布

培养

在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显________选择培养基上的数目，才说明选择培养基有________作用

计数

①如果得到了____________菌落数目符合要求的平板，则说明稀释操当菌落数目________时，选取菌作比较成功；

落数在______的平板进行计数。②如果同一稀释倍数的三个重复的在同一稀释度下，至少对______菌落数相差较大，表明实验不精确，个平板进行重复计数，然后求出需要______________；

________，并根据平板所对应的③在菌落计数时，每隔24 h统计一稀释度计算出样品中细菌的数目

次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目

2.讨论

(1)为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？

(2)不同的微生物培养的温度和时间相同吗？

3.菌落特征：包括菌落的形状、大小、隆起程度和颜色等。

4.菌种的鉴定

挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含________培养基的斜面中，由于细菌合成的________酶分解尿素产生了________，使培养基的碱性增强，pH上升，使指示剂变色，菌落周围变________。

归纳提炼

分离尿素分解菌操作中的注意事项

(1)在实验操作中，每个步骤都要注意无菌操作，以防培养基被污染，影响实验效果。

(2)样品稀释液的最佳浓度为获得每个平板上有30～300个菌落，这个稀释度细菌一般为104、105、106倍液，放线菌一般为103、104、105倍液，真菌一般为102、103、104倍液。

(3)为排除非测试因素(培养基)的干扰，实验需设置空白牛肉膏蛋白胨培养基进行对照。

(4)每一稀释倍数的菌液都至少要涂布3个平板，作为实验重复，求其平均值，若其中有菌落数与其他实验差距悬殊的，需要对该平板重新制作。

3.下列是关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述，其中错误的是(

) A.用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板

B.取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于各组平板上

C.将实验组和对照组平板倒置，37 ℃恒温培养24～48小时

D.确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数

[问题导析]

(1)设置不同____________的土壤稀释液，可以对照说明________________对细菌计数的影响。

(2)对细菌进行计数时，制作的平板大小为每个平板上生长有________个菌落。

4.测定土壤中细菌数量一般选用104、105和106倍的稀释液进行平板培养，而测定真菌的数量一般选用102、103和104倍稀释，其原因是(

) A.细菌个体小，真菌个体大

B.细菌易稀释，真菌不易稀释

C.细菌在土壤中数量比真菌多

D.随机的，没有原因

[问题导析]

土壤中各类微生物的________是不同的，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的__________进行分离。

1.通常用来作为菌种鉴定的重要依据是(

) A.菌落

B.细菌形态

C.细菌体积

D.细菌结构

2.从土壤中分离以尿素为氮源的细菌，下列实验操作不正确的是(

) －－A.将土壤用无菌水稀释，制备103～106土壤稀释液

B.将不同浓度的土壤稀释液涂布于不同平板上

C.用加入刚果红指示剂的选择培养基筛选分解尿素的细菌

D.从周围出现红色环带的菌落中挑取能够分泌脲酶的菌株

3.请选出下列正确的操作步骤(

) ①土壤取样

②称取10 g土壤，取出加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中

③吸取0.1 mL土壤溶液进行平板涂布

④依次稀释至101、102、103、104、105、106、107稀释度

A.①→②→③→④

B.①→③→②→④

C.①→②→④→③

D.①→④→②→③

4.在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂的目的是(

) A.筛选出能分解尿素的细菌

B.对分离的菌种作进一步鉴定

C.作细菌的营养成分

D.如指示剂变蓝就能准确地认定该菌能分解尿素

5.尿素是一种重要的农业肥料，但若不经细菌的分解，就不能更好地被植物利用。生活在土壤中的微生物种类和数量繁多，同学们试图探究土壤中微生物对尿素是否有分解作用，设计了以下实验，并成功筛选到能高效降解尿素的细菌(目的菌)。培养基成分如下表所示，实验步骤如图所示。请分析回答。

KH2PO4

Na2HPO4

MgSO4·7H2O 葡萄糖

尿素

琼脂

1.4 g 2.1 g 0.2 g 10.0 g 1.0 g 15.0 g

将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL。

(1)此培养基________(填“能”或“不能”)用于植物组织培养，理由是_________。

(2)培养基中加入尿素的目的是__________________，这种培养基属于________培养基。

(3)“目的菌”生长所需的氮源和碳源分别来自培养基中的__________和__________，实验需要振荡培养，原因是__________________________________________。

(4)图中将细菌转到固体培养基上时，可采用______________或__________________在含尿素的培养基上接种，获得单菌落后继续筛选。初步筛选出来的菌种还需要用生化的方法作进一步的鉴定：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入________指示剂，接种并培养初步筛选的菌种，若指示剂变成________色，则可准确说明该菌种能够分解尿素。

(5)在实验中，下列材料或用具需要灭菌的是________，需要消毒的是________(填序号)。

①培养细菌用的培养基与培养皿

②玻棒、试管、锥形瓶和吸管

③实验操作者的双手

(6)实验结束后，使用过的培养基应该进行________处理后，才能倒掉。

提醒：完成作业

专题2

训练6

答案精析

一

知识梳理

1.(1)DNA聚合酶

(2)耐热的Taq细菌

(4)目的菌株

pH

抑制

阻止

(5)特定

抑制

阻止

(6)①固体

琼脂

②选择

氮源

选择

2.稀释涂布平板法

(1)①一个活菌

②30～300

③菌落数

(2)某一稀释度下平板上生长的平均菌落数

涂布平板时所用的稀释液的体积

稀释倍数

(3)稀释度

(4)当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落

菌落数

3.(1)二

设置重复实验组

相差太大

操作有误

重新实验

(2)非测试

可信度

(3)方案一：其他同学用与A同学一样的土样进行实验，如果结果与A同学一致，则证明A同学操作无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。

方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。

通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照实验的设置是必不可少的。

活学活用

1.C

[固氮细菌可以在无氮培养基上生长；青霉素可以抑制细菌和放线菌的生长，但不会抑制霉菌的生长；加入10%的酚的培养基可以抑制细菌和霉菌的生长，但不会抑制放线菌的生长。]

问题导析

固氮

细菌

2.D

[用稀释涂布平板法对样品中活菌数目进行统计，只是一种估测，根据此方法的实验过程可知，在某一稀释度下涂布的平板菌体数具有一定的偶然性，并不是绝对均匀，所以取若干个平板菌落数量的平均值比较接近样品中菌株数的真实值。]

问题导析

(1)30～300

(2)平均数

二

知识梳理

1.中性

潮湿

3 cm

灭菌

3～8 cm

70%～90%

尿素

选择

对照

选择

10

90

1

9

0.1

平板涂布

低

高

火焰

103～107

标记

稀释度

30～37

多于

选择

稳定

30～300

3

平均值

2个或2个以上

重新实验

2.(1)①原因：土壤中各类微生物的数量(单位：株/kg)是不同的，因此为获得不同类型的微生物就需要按不同的稀释度进行分离。

②稀释度

微生物

细菌

放线菌

真菌

稀释度

104、105、106

103、104、105

102、103、104

③目的：保证获得菌落数在30～300的平板进行计数。

(2)培养不同微生物往往需要不同培养温度和培养时间。

微生物

细菌

放线菌

霉菌

培养温度

30～37 ℃

25～28 ℃

25～28 ℃

培养天数

1～2 d 5～7 d 3～4 d

4.酚红

脲

氨

红

活学活用

3.D

[检测土壤中细菌总数，用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板，A项正确；取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于不同的平板上，B项正确；接种后要将培养皿倒置，37 ℃恒温培养24～48小时，C项正确；在确定对照组无菌后，应选择菌落数在30～300的平板进行计数，D项错误。]

问题导析

(1)稀释度

稀释倍数

(2)30～300 4.C

[土壤中的微生物大约70%～90%是细菌，真菌的数量要比细菌少。样品的稀释度越高，在平板上生长的菌落数目就越少。在实际操作中，通常选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在30～300之间，适于平板计数，所以细菌的稀释倍数要高于真菌的稀释倍数。]

问题导析

数量

稀释度

课堂小结

目的菌株

稀释涂布平板法

显微镜直接计数法

当堂检测

1.A

[细菌个体非常小，不易直接观察，不同细菌菌落的形态特征不同，而且可以用肉眼观察，因此常作为鉴定菌种的依据。]

2.C

[从土壤中分离以尿素为氮源的细菌时，将土壤用无菌水稀释，制备土壤稀释液；将不同浓度的土壤稀释液涂布于不同平板上；用加入酚红指示剂的鉴别培养基可以鉴别分解尿素的细菌；从周围出现红色环带的菌落中挑取能够分泌脲酶的菌株。]

3.C 4.B

[筛选出能分解尿素的细菌用选择培养基即可，不需要加指示剂。加入指示剂的培养基，目的是对要分离的菌种作进一步的鉴定。]

5.(1)不能

缺少植物激素(或缺少植物需要的一些营养成分)

(2)筛选目的菌

选择

(3)尿素

葡萄糖

为目的菌提供氧气

(4)平板划线法

稀释涂布平板法

酚红

红

(5)①②

③

(6)灭菌

解析

(1)植物组织培养基中需要含有氮、磷、钾及锌、铜、钼、铁等元素，需要蔗糖为植物细胞提供能量，还需要细胞分裂素和生长素等植物激素。(2)该培养基中尿素是唯一的氮源，只有能利用尿素的微生物才能生长，属于选择培养基。(3)“目的菌”生长所需的氮源和碳源分别来自培养基中的尿素和葡萄糖，分解尿素的微生物是需氧型生物，所以在培养过程中需振荡。(4)在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养利用尿素的细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，由此可准确地鉴定该种细菌能够分解尿素。(5)微生物培养时，一切环境、物质、用具、器材都要消毒或灭菌。(6)为避免实验后培养基中的微生物污染环境，使用过的培养基必须经过灭菌处理后才能丢弃。