课题3　血红蛋白的提取和分离教案3

课题3

血红蛋白的提取和分离

1．了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。(重点) 2．体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程与方法。(难点)

蛋

白

质

分

离

的

原

理

和

方

法

1．分离蛋白质的原理

②所带电荷的性质和多少蛋白质特性的差异③溶解度④吸附性质⑤对其他分子的亲和力2．分离蛋白质的方法

(1)凝胶色谱法：

①分子的形状和大小

①概念：也称做分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。

形态：微小的多孔球体②凝胶组成：大多数由多糖类化合物构成结构：内部有许多贯穿的通道

③原理：相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内部的通道，通过的路程较长，移动速度较慢，因此可将各种相对分子质量不同的蛋白质分离。

(2)电泳：

①概念：指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。

②原理：

a．许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这

些基团会带上正电或负电。

b．在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。

c．电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。

③方法：常用的电泳方法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。

3．缓冲溶液

(1)作用：在一定范围内，抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变。

(2)配制：由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成，通过调节缓冲剂的使用比例就可以得到不同pH范围内使用的缓冲液。

[合作探讨]

探讨1：凝胶色谱法分离过程是怎样的？

提示：蛋白质混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→先收集大分子→后收集小分子。

探讨2：凝胶的成分是什么？凝胶有何特点？

提示：成分：大多数是多糖类化合物构成的一些微小的多孔球体，如葡聚糖或琼脂糖。特点：小球体内部有许多贯穿的通道，可以分离不同相对分子质量的蛋白质。

[思维升华]

1．蛋白质分离的依据

蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等，可以用来分离不同种类的蛋白质。

2．蛋白质分子在凝胶中的运动情况分析

直径大小

运动方式

运动速度

运动路程

洗脱顺序

3.电泳

相对分子质量大

大于凝胶颗粒

空隙直径

垂直向下运动

较快

较短

先从凝胶柱中洗脱出来

相对分子质量小

小于凝胶颗粒

空隙直径

无规则的扩散运动

较慢

较长

后从凝胶柱中洗脱出来

琼脂糖凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳

由于琼脂糖本身不带电荷，各在凝胶中加入SDS，使蛋白质解聚种分子在电场中迁移速率决定于所带电荷性质的差异及分子的大小、形状的不同

成单链，与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，使其迁移速率完全取决于分子的大小

1．利用凝胶色谱法先洗脱出来的蛋白质是(

) A．相对分子质量大的

B．溶解度高的

C．相对分子质量小的

D．所带电荷多的

【解析】

相对分子质量较小的蛋白质能进入凝胶内部通道，路程较长，移动速度较慢；相对分子质量大的蛋白质，路程较短，移动速度较快，首先洗脱出来。

【答案】

A 2．下列有关缓冲溶液的说法，不正确的是(

) A．缓冲溶液能够抵制外界任何酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变

B．缓冲溶液通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成

C．调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲溶液

D．生物体内的各种生物化学反应都是在一定的pH下进行的

【解析】

缓冲溶液通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲溶液。在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变，超过一定范围，缓冲溶液就起不到这样的作用了。

【答案】

A 3．SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法中加入SDS的作用是

(

) 【导学号：05520041】

A．增大蛋白质的相对分子质量

B．改变蛋白质分子的形状

C．掩盖不同蛋白质分子间的电荷差别

D．减小蛋白质分子的相对分子质量

【解析】

SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二、三级结构。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS

后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白质—SDS胶束，所带的负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异，从而仅根据蛋白质分子亚基的不同就能分离蛋白质。

【答案】

C

蛋

白

质

提

取

和

分

离

的

实

验

操

作

1．样品处理

(1)红细胞的洗涤：

①目的：去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。

②方法：

(2)血红蛋白的释放：

①目的：使红细胞破裂释放血红蛋白。

②过程：

(3)分离血红蛋白溶液：

将混合液离心→将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶沉淀层→于分液漏斗中静置片刻→分离出下层的红色透明液体。

2．粗分离——透析

(1)过程：取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将其放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12 h。

(2)目的：将相对分子质量较小(填“大”或“小”)的杂质除去。

(3)原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。

3．纯化——凝胶色谱操作

(1)凝胶色谱柱的制作：

①取长40 cm，内径为1.6 cm的玻璃管，两端需用砂纸磨平。

②柱底制作：打孔→挖凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。

③柱顶制作：打孔→安装玻璃管。

④组装：将上述三者按相应位置组装，并在下端出口连接带开关的尼龙管，尼龙管放入收集器。

(2)凝胶色谱柱的装填：

①色谱柱固定于支架上。

②干凝胶的计算和称量。

③溶胀：干凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。

④装填：打开下端出口，将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内。

⑤洗涤平衡：装填完后，立即连接洗脱瓶，用20 mmol/L的磷酸缓冲液洗涤平衡凝胶12 h。

(3)样品的加入和洗脱：

调整缓冲液面：与凝胶面平齐

↓

滴加透析样品：用量为1 mL

↓

样品渗入凝胶床：样品完全进入凝胶层

↓

洗脱：打开下端出口，用磷酸缓冲液洗脱

↓

收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5 mL 收集一管，连续收集

4．纯度鉴定

在鉴定的方法中，使用最多的是SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。

[合作探讨]

探讨1：洗涤红细胞时能否用蒸馏水代替生理盐水？

提示：不能。生理盐水能保持红细胞的渗透压稳定而不至于破裂，在未洗净血浆中的杂质蛋白前，红细胞如果提前破裂，就可能使血红蛋白与杂质血浆蛋白混在一起，加大了分离的难度。

探讨2：在血红蛋白释放过程中，加入蒸馏水和甲苯的目的是什么？

提示：(1)加入蒸馏水使红细胞吸水涨破。

(2)细胞膜的主要成分为磷脂，易溶于甲苯等有机溶剂，加入甲苯能加速红细胞破裂并释

放出血红蛋白。

探讨3：血红蛋白呈现红色，这一特点对进行蛋白质的分离有什么意义？

提示：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断收集洗脱液的时机。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。

[思维升华]

1．样品处理、分离与纯化的目的不同

红细胞洗涤

血红蛋白释放

分离血红蛋白溶液

透析

纯化

2.对实验的分析

(1)对血液样品处理后样品发生的变化

①正常现象：由于血红蛋白与氧气结合呈鲜红色，与二氧化碳结合呈暗红色，所以刚分离的血红蛋白溶液呈红色。

②分层不明显的原因：洗涤次数少，未完全除去血浆蛋白。

③红细胞不纯净的原因：离心速度过高或时间过长，使白细胞和淋巴细胞一同沉淀而造成。

(2)判断装填的凝胶色谱柱成功与否

①判断方法：

a．在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填均匀。

b．加入大分子的有色物质，观察色带移动情况。

②成功的标准及调整：

判断标准：若色带均匀、狭窄、平整，说明性能良好。

调整方法：若色谱柱内出现纹路或是气泡，可轻轻敲打柱体以消除气泡，若消除不了则重新装柱。

(3)对分离效果的判断

①若血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整地随洗脱液缓慢流出，则装填成功，分离操作正确。

②若血红蛋白的红色区带歪曲、散乱、变宽，则说明分离效果不好，装填不成功。

目的

去除杂质，如血浆蛋白

使红细胞破裂，释放血红蛋白

经过离心使血红蛋白与其他杂质分离开

除去样品中相对分子质量较小的杂质

除去相对分子质量较大的蛋白质

1．在蛋白质的提取和分离中，关于对样品的处理，分析正确的是(

) A．洗涤红细胞的目的是除去血浆中的葡萄糖、无机盐

B．洗涤时离心速度过慢，时间过短，白细胞等会沉淀，达不到分离的效果

C．洗涤过程选用质量分数为0.1%的NaCl溶液

D．透析的目的是去除样品中相对分子质量较小的杂质

【解析】

本题主要考查了血红蛋白提取和分离中的样品处理。洗涤红细胞的目的主要是除去血浆中的蛋白质；洗涤时离心速度过快，时间过长，会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果；洗涤过程用到的是质量分数为0.9%的NaCl溶液。故正确答案为D。

【答案】

D 2．下列是有关血红蛋白的提取与分离的问题，请回答下列问题。

(1)人们用鸡的红细胞提取DNA，用人的红细胞提取血红蛋白，其原因是

________________________________________________________________ ________________________________________________________________ _______________________________________________________________。

(2)凝胶色谱法是根据______________分离蛋白质的有效方法。所用的凝胶实际上是一些______________。

(3)蛋白质的提取和分离实验中，首先要用__________________(填写溶液名称)洗涤红细胞，其目的是去除________。

(4)在________和甲苯的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。用________法可分离出血红蛋白。

(5)取血红蛋白溶液装入透析袋，再将透析袋放入pH为7.0的________中，透析12 h。

【解析】

哺乳动物的红细胞退化，没有细胞核和细胞器，没有DNA，血红蛋白含量丰富；而鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，可以用于提取DNA。凝胶色谱法也叫做分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，使用的洗涤液是生理盐水，要重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，不能用清水或蒸馏水洗涤，因为生理盐水可以使红细胞维持正常的形态。释放出的血红蛋白用离心的方法进行分离。为避免破坏蛋白质的空间结构，要用磷酸缓冲液进行透析，以保证pH的相对稳定。

【答案】

(1)鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，适合用于提取DNA；人的红细胞无细胞核，且血红蛋白含量丰富，适合用于提取血红蛋白

(2)相对分子质量的大小

微小的多孔球体

(3)生理盐水

杂蛋白

(4)蒸馏水

离心

(5)(磷酸)缓冲液

1．下列关于样品的加入和洗脱的操作不正确的是(

) A．加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面

B．加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内

C．等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口

D．用吸管小心地将1 mL透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面

【解析】

加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐。

【答案】

A 2．相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的分离过程可表示为下列哪一项

(

)

【解析】

相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子可以进入凝胶颗粒内部，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量较小的蛋白质后流出。

【答案】

B 3．凝胶柱制作的顺序一般是(

)

【导学号：05520042】

①橡皮塞打孔

②挖凹穴

③装玻璃管

④盖尼龙网

⑤盖尼龙纱

⑥将橡皮塞插入玻璃管

⑦接尼龙管、装螺旋夹

⑧柱顶插入安装玻璃管的橡皮塞

A．①③④⑤⑥⑧⑦②

B．①②③④⑤⑥⑦⑧

C．①②③④⑥⑤⑧⑦

D．①②③⑦⑥⑤⑧④

【解析】

凝胶柱制作的一般流程是：选择玻璃管→选择合适的橡皮塞→打孔→挖凹穴→盖尼龙网→盖尼龙纱→将橡皮塞插到玻璃管→接尼龙管→装螺旋夹→柱顶插入安装玻璃管的橡皮管。

【答案】

B 4．血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，负责血液中O2或CO2的运输。请根据血红蛋白的提取和分离流程图回答问题。

(1)将实验流程补充完整：A为________________，B为________________。凝胶色谱法是根据________________而达到蛋白质分离的有效方法。

(2)洗涤红细胞的目的是去除________，洗涤次数过少，无法除去________________；离心速度过高和时间过长会使______________一同沉淀，达不到分离的效果。洗涤干净的标志是____________________。释放血红蛋白的过程中起作用的是________________。

(3)在洗脱过程中加入物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液(pH为7.0)的目的是____________________________________________________________ _______________________________________________________________。

如果红色区带________，说明色谱柱制作成功。

【解析】

凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法，在蛋白质提取与分离过程中包括样品的处理、粗分离、纯化和纯度鉴定四步，每一步均应用了不同的操作技术，需要注意。

【答案】

(1)血红蛋白的释放

样品的加入和洗脱

相对分子质量的大小

(2)杂蛋白(血浆蛋白)

血浆蛋白

白细胞和淋巴细胞

离心后的上清液中没有黄色

蒸馏水和甲苯

(3)准确模拟生物体内的生理环境，保持体外的pH和体内一致

均匀一致地移动

课堂小结：

网络构建

核心回扣

1.凝胶色谱法分离蛋白质取决于相对分子质量的大小，相对分子质量大的路程较短，移动速度快；相对分子质量较小的，路程较长，移动速度慢。

2．缓冲液能在一定范围内抵制外界酸、碱对溶液

pH的影响，维持pH基本不变。

3．电泳时，带电分子会向其所带电荷相反的电极移动。

4．蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。

5．血红蛋白溶液离心后分为四层，从上到下依次为：无色透明的甲苯层、白色薄层固体(脂溶性物质的沉淀层)、红色透明液体(血红蛋白的水溶液)和其他杂质的暗红色沉淀物。

6．在电泳中，待分离样品中分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状都会影响分子的迁移速度。

7．SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的迁移率完全取决于分子的大小。