课题3　血红蛋白的提取和分离课堂实录【3】

血红蛋白的提取和分离教学设计

山西省孝义中学校

郭丽芬

课标领航

1．概述凝胶色谱法、电泳法等分离大分子的基本原理。

2．能根据凝胶色谱过程中的现象和结果，评价实验操作的过程是否规范，分析实验结果。

3．尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，体验从复杂的体系中提取生物大分子的基本过程和方法。

【重点】

凝胶色谱法、电泳法基本原理。

【难点】

实验操作的过程及分析。

教学过程

以任务为驱动，完成实验设计

任务1.材料的选择

（1）为什么选择红细胞为材料？

（2）选择什么动物的红细胞为材料？为什么

（3）为防止血液凝固，需要做什么？

选用哺乳动物红细胞作分离蛋白质的实验材料，下列不是其优点的是( ) A．血红蛋白是有色蛋白

B．红细胞无细胞核

C．红细胞蛋白质含量高

D．红细胞DNA含量高

任务2、确定实验思路

血液——红细胞——血红蛋白

（1）血液中除了红细胞，还有什么，怎么得到红细胞？

（2）怎么得到血红蛋白？

（3）通过你的操作，得到的血红蛋白是纯净的么？还需要做什么？

血液——红细胞——血红蛋白

1、红细胞的洗涤

2、血红蛋白的释放

3、分离血红蛋白溶液

洗涤红细胞的目的是什么？

除去血浆蛋白的杂蛋白，有利于后续步骤的分离纯化。

红细胞的洗涤过程为：血液＋柠檬酸钠→低速短时离心→吸出上层血浆→红细胞＋5倍体积生理盐水→缓慢搅拌10min→低速短时离心→吸出上清液→反复洗涤直至上清液无黄色

思考：加入柠檬酸钠有何目的？为什么要低速、短时离心？为什么要

缓慢搅拌？

防止血液凝固；防止白细胞沉淀；防止红细胞破裂释放出血红蛋白。

思考：你有什么方法将红细胞中的血红蛋白释放出来？

加入蒸馏水，用玻璃棒快速搅拌一段时间。

补充：加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。加入甲苯的目的是溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放和分离。此时，红细胞破碎混合液中不仅含有血红蛋白，而且还含有细胞破碎物、脂质、甲苯有机溶剂等。怎样除去这些杂质呢？由于它们的密度不同，科学家采取了离心分离的方法：

红细胞破碎混合液→中速长时离心（2000c/min×10min）→滤纸过滤除去脂质→分液漏斗分离出血红蛋白

任务三血红蛋白的粗分离

透析过程中如何去除无机盐离子和小分子有机物？

半透膜——大分子物质不能通过半透膜，离子和小分子能够通过半透膜。在透析过程中，血红蛋白溶液中的离子和小分子不断通过半透膜扩散进入到pH＝7的磷酸缓冲液中。

凝胶色谱分离蛋白质包括：制作色谱柱、装填色谱柱、样品加入和洗脱。

根据教材图5－19，说出制作色谱柱需要的材料。

橡皮塞2个、打孔器、小刀、移液管、尼龙纱、尼龙网、玻璃管、尼龙管等。

色谱柱的制作过程：准备材料→加工橡皮塞→安装色谱柱

下面进行第二步凝胶色谱柱的装填。请阅读教材：

色谱柱的装填过程。

样品加入和洗脱。其基本过程是：

调节缓冲液面→加入蛋白质样品→调节缓冲液面→洗脱→收集分装蛋白质

至此，血红蛋白即可得到粗分离。在整个操作过程中，应当注意以下事项：

（1）红细胞的洗涤：洗涤次数不能过少；低速、短时离心。

（2）凝胶的预处理：沸水浴法时间短，还能除去微生物和气泡

（3）色谱柱的装填：装填尽量紧密，降低颗粒间隙；无气泡；洗脱液不能断流。

（4）色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。

（四）纯度鉴定

电泳

SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳

总结：

蛋白质的提取和分离一般分为四步：

（1）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白的释放；离心等操作收

集血红蛋白溶液。

（2）粗分离：透析除去分子较小的杂质。

（3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。

（4）纯度鉴定：通过SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。

跟踪训练1、下列有关提取和分离血红蛋白的叙述不正确的是（ ）

A. 样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液

B. 通过透析可以去除样品中分子质量较大的杂质，此为样品的粗提取

C. 可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化

D. 可通过SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度

跟踪训练2、凝胶色谱柱取长为40 cm，内径为1．6 cm的玻璃管，有关说法中，不正确的是 ( ) A．一般凝胶色谱柱直径的大小不影响分离的效果

B．凝胶色谱柱过高超过1 m，不影响分离的效果

C．凝胶色谱柱过矮，则影响混合物的分离度

D．凝胶色谱柱直径过大会耗用过多洗脱液，样品的稀释度过大

跟踪训练3、细菌蛋白质在极端环境条件下可通过肽链之间的二硫键维持稳定。已知不同的多肽产物可因分子量不同而以电泳方式分离。下列左图是一个分析细菌蛋白的电泳结果图，“-”代表没加还原剂，“+”代表加有还原剂，还原剂可打断二硫键，“M”代表已知分子量

的蛋白质，右侧数字代表蛋白质或多肽的相对分子量。根据左侧结果，下列哪个图案最能代表该细菌原本的多肽结构（注意：“一”代表二硫键（ ）

跟踪训练4、如图为DNA测序仪显示的某真核生物DNA片段一条链的碱基排列顺序图片，其中图甲的碱基序列已经解读，其顺序是：

GGTTATGCGT。图乙的碱基序列为：( ) A.GGTTATGCGT B．CCAATACGCA

C.GATGCGTTCGDGCTTGCGTAG

教学反思：课程实施过程侧重理论分析，结合学生实验过程中的问题具体分析，更能提高该节课的掌握程度。