课题3　血红蛋白的提取和分离课程导入

导学案

年级：高二

科目：生物

主备：朱桂平

审核：薛龙

课题：5.3血红蛋白的提取和分离

课型：新授

课时

:

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一、辅助环节

【教学目标】

知识与技能: 1、尝试从血液中提取和分离血红蛋白2、了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理

过程与方法: 体验血红蛋白提取和分离的实验的严格要求，注意按照操作提示进行相关步骤

情感态度与价值观: 初步形成科学的思维方式，发展科学素养和人文精神

【重点难点】重点: 凝胶色谱法的原理和方法

难点: 样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填

二、先学环节

（一）凝胶色谱法

1、概念：凝胶色谱法也称做 ，是根据 分离蛋白质的有效方法。

2、原理：根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。

3、凝胶

①性质：一些微小的多孔球体，内含许多 的通道，它只准许 的蛋白质进入。

②化学本质：多糖类化合物---葡聚糖或琼脂糖。

4、具体过程：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质 进入凝胶内部的通道，路程 ，移动速度 ；而相对分子质量 的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在

移动，路程 ，移动速度 。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。

（二）缓冲溶液

1、定义：在一定范围内，缓冲液能够抵制外界的 和 对溶液 的影响，维持 基本不变。

2、作用：能够抵制外界的酸或碱的对溶液的PH值的影响，维持PH 。

3、配制：通常由 种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使

用的缓冲液。

4、缓冲剂：人体血浆的为H2CO3/NaHCO3 NaH2PO4 /Na2HPO4

5、实验必须使用缓冲溶液的原因：维持反应体系的pH不变。

（三）电泳

1、概念：指 在电场的作用下发生 的过程。

（1）.许多重要的生物大分子，如 、 等都具有 ，在一定的

下，这些基团会带上 或 。

2、原理

（2）.在电场的作用下，这些带电分子会向着与其 的电极移动。

（3）.电泳利用了待分离样品中各种分子 以及分子本身的 、 的不

同，使带电分子产生不同的 ，从而实现样品中各种分子的分离。

3、电泳的类型：常用的电泳方法是 和 等2种，在测定蛋白质分子量时通常使用 。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于

以及 等因素。

4、SDS的作用：使蛋白质发生完全 ，水解成单条肽链，使电泳迁移率完全取决于 。

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实验操作

1、基本步骤：样品处理

→

粗分离

→

纯化

→

纯度鉴定

2、特别强调：每一种蛋白质的分离纯化方法因其来源和性质的不同差异 。

（一）样品处理及粗分离

1、血液组成

步骤：

1、红细胞的洗涤 洗涤红细胞的目的是 ，以利分离纯化。采集的血样要及时采用 分离红细胞，然后用胶头吸管吸出上层透明的 ，将下层暗红色的 液体倒入烧杯，再加入 ，缓慢搅拌10min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至 ，表明红细胞已洗涤干净。

2、血红蛋白的释放 在 和 作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。

3、分离血红蛋白溶液 将搅拌好的混合溶液离心后，试管中的溶液分为4层：

第1层为无色透明的 ，

第2层为白色薄层固体，是 ，

第3层是红色透明液体，这是 ，

第4层是其他杂质的 。 将试管中的液体用滤纸过滤，除去之溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的

红色透明液体。

4、透析 取1mL的血红蛋白溶液装入 中，

将透析袋放入盛有300mL的物质的量的浓度为

20mmol/L的 中，透析12h。透析

可以去除样品中 的杂质，

或用于更换样品的 。如右图：

（二）凝胶色谱操作

1、制作步骤：打孔→挖穴→安管→覆网→插管

2、凝胶色谱柱的装填

注意：

1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。 2、装填凝胶柱时不得有 存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。

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3、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。4、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。

3、样品加入与洗脱

（1）调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面 ，关闭出口。

（2）滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环 加样，

同时注意不要 凝胶面。

（3）样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出

口。

（4）洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行

洗脱。

（5）收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离

过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）

（6）注意：正确的加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。 2、贴壁加样。 3、使吸管管口沿管壁环绕移动。

三、后教环节

注意：

1、在血红蛋白纯化的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的：让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构

和功能正常。

2、与其他蛋白质相比，血红蛋白的特点和分离的启示：血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通

过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。 3、血红蛋白分离的完整过程：

血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。

首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即: ；

再经过透析去除分子量较小的杂质，即 ；

然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去，即: ；

最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行 。

四、当堂训练

1：凝胶色谱法是根据（ ）分离蛋白质的有效方法。

A．分子的大小 B．相对分子质量的大小 C．带电荷的多少 D．溶解度

2：电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷（ ）的电极移动。

A．相同

B．相反

C．相对

D．相向

3：为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂（ ）

A．NaCl

B．甲苯

C．蒸馏水

D．柠檬酸钠

4：将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，可以明显看到试管中的溶液分为4层，其中第3层是（ ）

A．无色透明的甲苯层 B．脂溶性物质的沉淀层 C．血红蛋白的水溶液

D．其他杂质的暗红色沉淀物

5：凝胶色谱法中所用的凝胶化学本质大多是（ ）

A．糖类化合物 B．脂质

C．蛋白质

D．核酸

6：相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个（ ）

7：用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质（ ）

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A．路程较长，移动速度较慢

C．路程较短，移动速度较慢

B．路程较长，移动速度较快

D．路程较短，移动速度较快

8：能进入凝胶内部通道的蛋白质是指（ ） A．相对分子质量大的 B．吸附性高的 C．相对分子质量小的 D．溶解度低的

9：缓冲液的作用是在一定范围内，抵制外界的影响来维持下列哪一项状态基本不变的（ ） A．温度

B．pH C．渗透压 D．氧气浓度

10：蛋白质提取和分离分为哪几步（ ） A．样品处理、凝胶色谱操作、SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳 B．样品处理、凝胶色谱操作、纯化

C．样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定 D．样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定

11：洗涤红细胞时，分离所用的方法为（ ） A．低速长时间离心

B．低速短时间离心 C．高速长时间离心

D．高速短时间离心

12：电泳时带电粒子在电场的作用下，移动所向的电极的方向与其所带电荷是（ ） A．相同

B．相反

C．相对

D．相向

13：下列有关提取和分离血红蛋白的程度叙述错误的是（ ）

A．样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液

B．通过透析可以去除样品中分子质量较大的杂质，此为样品的粗提取

C．可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化

D．可通过SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度

14：(2011年邵阳高二检测)如图表示血红蛋白提取和分离的部分实验装置，请据图回答下列问题。

(1)血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，它在红细胞中的作用

体现了蛋白质具有__________功能。

(2)甲装置中，B是血红蛋白溶液，则A是________________；乙装置中，

C溶液的作用是____________________。

(3)甲装置用于____________，目的是________________________。用乙装置

分离蛋白质的方法叫__________________，是根据____________________分离蛋白质的有效方法。

(4)用乙装置分离血红蛋白时，待__________________________________时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集。

15：《“十一五”将建12项重大科技基础设施》被2007年12月28日评为2007年国内十大科技新闻之一，其中的12项中的一项为“蛋白质科学研究设施”。这是由于随着人类基因组计划的进展以及多种生物基因测序工作的完成，人类跨入了蛋白质时代。对蛋白质的研究和应用，首先需要获得高纯度的蛋白质。请回答下列问题：

（1）蛋白质的提取和分离一般分为四步：_________、________、_________和纯度鉴定。

（2）如果要从红细胞中分离出血红蛋白，实验前取新鲜血液要在采血容器中预先加入柠

檬酸钠，这样做的目的是__________________________________。

（3）血红蛋白的提取又可以细分为：红细胞的洗涤、______________、分离血红蛋白溶

液和_______。其中分离血红蛋白溶液时需要用到_______（仪器）分出下层红色透明液体。

（4）装填凝胶色谱柱时，要注意色谱柱内不能有气泡存在，一旦发现有气泡必须重新装。

这是因为____________________________________________。

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当堂训练答案

BBDCA BDCBC BBB 14、(1)运输

(2)磷酸缓冲液 洗脱血红蛋白

(3)透析(粗分离) 去除样品中相对分子质量较小的杂质 凝胶色谱法 相对分子质量的大小

(4)红色的蛋白质接近色谱柱底端

15、（1）样品处理

粗分离 纯化 （2）防止血液凝固

（3）血红蛋白的释放 透析 分液漏斗 （4）气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果

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