课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数第二课时教案

《土壤中分解尿素的细菌的分离与计数》教学设计

【教学目标】

1.研究培养基对微生物的选择作用。

2.进行微生物数量的测定。

一、研究思路

1．筛选菌株

（1）实验室中微生物筛选的原理

人为提供有利于________________生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时________或________其他微生物生长。

（2）选择培养基

在微生物学中，将允许__________种类的微生物生长，同时________或________其他种类微生物生长的培养基，称做选择培养基。

（3）分离分解尿素的细菌的选择培养基

①在该培养基配方中，为微生物的生长提供碳源的是____________，提供氮源的是________，琼脂的作用是凝固剂。

②该培养基对微生物具有选择作用。其选择机制是________________________________才能在该培养基上生长。

③土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们体内能合成________，将尿素分解的反应式是________________________________________________________。

Taq细菌能忍受93℃左右的高温，是在美国黄石国家公园的一个热泉中发现的，这说明，在寻找目的菌株时，要根据____________________________________________。

2．统计菌落数目的方法

（1）稀释涂布平板法(也叫活菌计数法) ①原理：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的____________，通过统计平板上的________，就能推测出样品中大约含有多少活菌。

②操作

第一，设置重复组，增强实验的说服力与准确性。将待测样品经一系列10倍稀释，然后选择________稀释度的菌液，分别取0.1 mL接种到已制备好的平板上，然后用无菌涂布器将菌液涂布整个平板表面，放在适宜的温度下培养并计算菌落数。为使结果接近真实值，可将

同一稀释度涂布到三个或三个以上的平板上，培养并计算出__________。

第二，为了保证结果准确，一般选择菌落数在________的平板进行计数，若设置的重复组中结果相差太远，意味着操作有误，需重新实验。

C③计算公式：每克样品中的菌株数＝×M，其中C代表___________________________，VV代表________________________________(mL)，M代表____________。

（2）显微镜直接计数法

①原理：此法利用特定的____________或______________，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量，但不能区分细菌的死活。计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的面积1 mm2和高0.1 mm的计数室，在1 mm2的面积里又被划分成25个(或16个)中格，每个中格进一步划分成16个(或25个)小格，计数室由________个小格组成。

②操作：将稀释的样品滴在计数板上，盖上盖玻片，然后在显微镜下计数4～5个中格中的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按公式求出每毫升样品中所含的细菌数。

③计数公式：每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10 000×稀释倍数。

（3）设置重复和对照

①设置重复：培养过程中应设置重复组，同一稀释度下应涂布________个平板，才能增强实验的说服力与准确性。

②设置对照：实验中应设置对照，主要目的是________________________对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。如__________对照组，观察培养物中是否有杂菌污染；设置________培养基，观察选择培养基是否具有________作用。

二、实验设计

实验步骤

1．土壤取样：从肥沃、湿润的土壤中，用无菌小铁铲铲去表层土3 cm左右，迅速取土壤并装入____________密封或事先准备好的________中。

2．制备培养基：①制备________________培养基作为对照组，尿素为唯一氮源的培养基作为________，用来判断选择培养基是否具有____________。

②放宽稀释范围，如稀释倍数为103～107范围内的要分别涂布，而每个稀释度下需要______个选择培养基、________个牛肉膏蛋白胨培养基，因此需要15个选择培养基和5个牛肉膏蛋白胨培养基。

③两种培养基应各有一个作为________对照，此外还需准备8个灭菌的试管和1个灭菌的移

液管。

3．样品的稀释与涂布平板：参考下面的实验流程示意图，将10 g土样加入盛有90 mL无菌生理盐水的锥形瓶中(锥形瓶体积为250 mL)，充分摇匀，吸取上清液1 mL，转移至盛有________ mL生理盐水的无菌大试管依次等比稀释至107稀释度，并按照由107～103稀释度的顺序分别吸取______mL进行平板涂布操作。按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管。

说明：图中的1、2、3平板是____________，4为____________________作对照，判断选择培养基是否具筛选作用，还有两个空白对照，即不涂布稀释后菌液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基，验证培养基中是否____________。

4．将涂布好的培养皿放在30℃温度下培养，及时观察和记录。

5．挑选选择培养基上不同形态的菌落接入含____________培养基的斜面中，观察能否产生颜色反应。

6．细菌的计数

当菌落数目稳定时，选取菌落数在________的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出____________，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。同时仔细观察所分离到的菌落，并记录菌落特征。

7．统计表格

表一

平板上的菌落数记录表

稀释倍数

103 104 105 106 107 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4

1 2

3 ⋮

表二

菌落特征记录表

菌落

形状

种类

1 2 3 ⋮

大小

程度

隆起颜色

……

注：一般来说，在一定的培养条件下(相同的培养基、温度及培养时间)，____________表现出________的菌落特征。

三、操作提示

1．取土样用的小铁铲和盛土样的信封在使用前都要________。

2．应在________旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入________中，塞好棉塞。

3．在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在________旁操作。

4．实验时要对________做好标记。注明________________________________________等。

5．为了提高效率，在操作时更加有条不紊，应当________________。

四、结果分析与评价

内容

有无杂菌污染的培养物中菌落数________→被杂菌污染

判断

菌落形态多样，菌落数偏高→培养物中混入____________ 选择培养基的筛选作用

样品的稀释操作

计数

若选取同一种土样，统计结果应________；如果结果相差太远，说明实验操重复组的结果

作过程中出现操作失误，需要找出产生差异的原因

五、课题延伸

牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目________选择培养基的数目→选择培养基具筛选作用，已筛选出一些菌落

得到2个或2个以上菌落数目在________的平板→操作成功，能进行菌落的结论分析

对照的培养皿中________菌落生长→未被杂菌污染

在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的________将尿素分解成了________。氨会使培养基的碱性增强，________升高。因此，我们可以通过检测培养基____________来判断该化学反应是否发生。

在以尿素为唯一氮源的培养基中加入________指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂将________，这样，我们就可以准确地鉴定该种细菌能够分解尿素。

六、对点训练

知识点一

研究思路

1．下表为本课题使用的培养基，分析培养基配方，回答下面的问题。

KH2PO4

Na2HPO4

MgSO4·7H2O 葡萄糖

尿素

琼脂

用蒸馏水定容到1 000 mL 1.4 g 2.1 g 0.2 g 10.0 g 1.0 g 15.0 g

(1)在该培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是____________________。

(2)按物理性质划分该培养基属于________培养基，理由是培养基中含有________________；该类培养基常用于微生物的______________________等。

(3)由于____________________________________________________________________，

所以该培养基只能用于能够合成________的微生物的培养。用此培养基培养土壤浸出液能够从土壤中筛选出________的细菌。

(4)在微生物学中，将_______________________________________________________ __________________的培养基，称作选择培养基。

2．广东省是我国甘蔗生产区之一。甘蔗是一种高光效的C4植物，单位面积产量很高，种植面积日益扩大，目前已成为南方地区燃料酒精生产的重要原料。利用甘蔗生产燃料酒精的一般工艺流程为：甘蔗→榨汁(蔗糖)→酵母发酵→蒸馏→成品(燃料酒精)。

(1)具有耐高糖和耐酸特性的酵母菌是理想的酒精发酵菌种，对野生酵母菌进行诱变后通过筛选可以得到具有这些特性的突变菌，诱变及筛选过程如下：

步骤1：野生菌液体培养一段时间后接受紫外线照射诱变处理。

步骤2：制备选择培养基。在基本培养基的基础上，注意________________和____________，加琼脂后灭菌，制成固体平板。

步骤3：将紫外线照射后的菌液稀释涂布平板。

步骤4：根据________________________________________________________________，筛选出突变菌。

(2)上述步骤2、3和4的依据分别是___________________________________________ ________________________________________________________________________。

知识点二

实验设计

3．用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，正确的是(

) A．涂布了1个平板，统计的菌落数是230 B．涂布了2个平板，统计的菌落数是215和260，取平均值238 C．涂布了3个平板，统计的菌落数分别是21、212和256，取平均值163 D．涂布了3个平板，统计的菌落数分别是210、240和250，取平均值233 4．在本实验操作中对使用的平板和试管要进行标记，以下说法正确的是(

) A．对培养皿仅需注明培养基的种类即可

B．一般在使用之后进行标记

C．由于试管用的较多，只需对试管进行标记即可

D．标记的目的主要是为了防止实验中平板、试管等的混淆

参考答案

一、1. (1)目的菌株

抑制

阻止

(2)特定

抑制

阻止

(3)①葡萄糖

尿素

②只有能够以尿素作为氮源的微生物

③脲酶

CO(NH2)2＋脲酶H2O――→CO2＋2NH3

它对生存环境的要求，到相应的环境中去寻找

2．(1)①一个活菌

菌落数

②三个

菌落平均数

30～300

某一稀释度下平板上生长的平均菌落数

涂布平板时所用的稀释液的体积

稀释倍数

(2)①细菌计数板

血细胞计数板

400

(3)①至少3

②排除实验组中非测试因素

空白

完全

筛选

二、1.(1)无菌信封

烧杯

(2)①牛肉膏蛋白胨

实验组

选择作用

②3

1

③空白

(3)9

0.1

选择培养基

牛肉膏蛋白胨培养基

含有杂菌

(5)酚红指示剂

(6)30～300

平均值

(7)同种微生物

稳定

三、1.灭菌

2.火焰

锥形瓶

3.火焰

4.培养皿

培养基类型、培养时间、稀释度、培养物

5.事先规划时间

四、无

偏高

其他氮源

大于

30～300

接近

五、脲酶

氨

pH

pH的变化

酚红

变红

对点训练

1．【答案】(1)葡萄糖和尿素

(2)固体

琼脂

纯化、分离、计数

(3)培养基中只有尿素一种氮源

脲酶

分解尿素

(4)允许特定种类的微生物生长，并能抑制或阻止其他种类微生物生长

【解析】

根据培养基的成分，可以推断培养基的类型以及适于培养的微生物的代谢类型。含有琼脂、明胶等凝固剂的培养基为固体培养基；不含凝固剂的为液体培养基。不含碳源的培养基适于自养微生物的培养，不含氮源的培养基适于固氮微生物的培养等。固体培养基常用于菌种的纯化、分离、记数等；液体培养基常用于菌种的扩大培养和工业生产。

2．【答案】(1)添加高浓度蔗糖(葡萄糖)

调低pH

是否能在选择培养基上生长

(2)提供高糖和酸性的筛选环境；获得单菌落；能生长的菌落具有耐高糖和耐酸的特性

【解析】

(1)要筛选耐高糖和耐酸的菌种，培养基中必须加入高浓度蔗糖和调低pH，能在选择培养基上生长的即为所需菌种。(2)步骤2是给其提供高糖或酸性的筛选环境；步骤3是为了获得单菌落；步骤4是根据能生长的菌株具有耐高糖和耐酸的特性筛选出突变菌。

3．【答案】D

【解析】在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性，所以A、B两项不正确。C项虽涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与另两个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地用3个平板的计数值求平均值。

4．【答案】D

【解析】为避免混淆，最好在使用前就做好标记，对培养皿标记时应注明培养基种类、培养日期以及平板上培养样品的稀释度等，故A、B错。C项试管不仅需进行标记，在梯度稀释时，还应按一定顺序依次放在试管架上。