课题3　血红蛋白的提取和分离教学设计

血红蛋白的提取和分离（第二课时）

重庆市南川中学校

张成林

上节课知识回顾：

1.分离生物大分子的基本思路：

选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。

2.蛋白质分离和提取的原理：

根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。

一、基础知识:

1 、分离生物大分子的基本思路是什么？

2 、不同蛋白质的特性在哪些方面存在差异？

3 、本课题我们将利用血红蛋白与杂质蛋白哪方面的差异进行提纯？

4 、为什么不用鸡的血红细胞而用人的血红细胞作为实验材料？

5 、用什么方法分离相对分子质量不同的蛋白质

？

进行新课：

二、实验操作：样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定

知识回顾

1. 血液有哪些成分？

血红蛋白的特点：

每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二

氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。

2.用鸡的红细胞提取DNA，用猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？

鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。

二、实验操作

（一）蛋白质提取和分离步骤

样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定

(2)血红蛋白的释放：加蒸馏水到原血液体积，再加40％体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟,细胞破裂释放出血红蛋白。①目的分析：使红细胞大量吸水胀破②蒸馏水的作用是______________________________。溶解红细胞的细胞膜③加入甲苯的作用是____________________________。加速红细胞的破裂④充分搅拌的目的是____________________________。

(3)分离血红蛋白溶液：将搅拌好的混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min。红细胞混合液高速离心10min 离心管脂类物质滤纸过滤烧杯分离：1.用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，2.用分液漏斗静置片刻后，分出下层的红色透明液体。

(3)分离血红蛋白溶液：试管中溶液层次：第1层：甲苯层（无色透明）；第2层：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）；第3层：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）；第4层：杂质沉淀层（暗红色）。

(4)透析：①过程：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋（硝酸纤维素）中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时。除去样品中分子量较小的杂质②透析目的：半透膜能使小分子自由进出，而大分子保留在袋内。思考下面的问题：

1、

在血红蛋白纯化的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？

让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能正常。

2、

与其他蛋白质相比，血红蛋白有什么特点？这一特点对你进行血红蛋白的分离有什么启示？

血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。

三、实验结果分析与评价1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。

2、你能观察到蛋白质的分离过程中红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？

如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看

到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。

教学反馈

1．凝胶色谱法是根据（

）分离蛋白质的有效方法。

A分子的大小

B相对分子质量的大小

C带电荷的多少

D溶解度

2．缓冲液的作用是：在一定范围内，抵制外界的影响来维持（

）基本不变。

A温度

B

pH

C渗透压

D氧气浓度

3．电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷（

）的电极移动。

A相同

B相反

C相对

D相向

4.

哺乳动物和人的成熟的红细胞中的（

）与氧气的运输有关。

A血红蛋白

B肌红蛋白

C肌动蛋白

D肌球蛋白

5．血液由血浆和各种血细胞组成，其中（

）的含量最多。

A白细胞

B血小板

C红细胞

D淋巴细胞

6．为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂（

）。

A.

NaCl

B.甲苯

C.蒸馏水

D.柠檬酸钠

7．将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，可以明显看到试管中的溶液分为4层，

其中第3层是（

）

A无色透明的甲苯层

B脂溶性物质的沉淀层

C血红蛋白的水溶液

D其他杂质的暗红色沉淀物

8、一分子血红蛋白最多可携带的

O2分子数和CO2分子数分别是

A

4、2

B

4、4

C

2、1

D、1、1