课题3　血红蛋白的提取和分离教学设计及教案分析

血红蛋白的提取和分离

一、蛋白质分离的原理和方法

1．分离原理

依据蛋白质各种特性的差异分离蛋白质，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等。

2．凝胶色谱法

(1)概念：也称为分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。

(2)凝胶：微小的多孔球体，大多数由多糖类化合物构成，内部有许多贯穿的通道。

(3)原理：[填表] 蛋白质类型

相对分子质量较小

相对分子质量较大

3．缓冲溶液

(1)作用：在一定范围内，抑制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变。

(2)配制：由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成，通过调节缓冲剂的使用比例就可以得到不同pH范围内使用的缓冲液。

4．电泳

(1)概念：指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。

(2)原理：

①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些

- 1 - 晨背要点

1.凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的方法，相对分子质量大的先洗脱出来，相对分子质量小的后洗脱出来。

2．在电泳中，待分离样品中分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状都会影响分子的迁移速度。

3．SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的迁移率完全取决于分子的大小。

4．蛋白质提取和分离的一般步骤是：样品处理及粗分离、纯化和纯度鉴定。

5．透析法可除去相对分子质量较小的杂质。

6．在对蛋白质进行纯度鉴定时，使用最多的方法是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。

能否进入凝胶内部

能

不能

移动路程

较长

较短

移动速度

较慢

较快

基团会带上正电或负电。

②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。

③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。

④方法：常用的电泳方法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。

二、血红蛋白提取和分离的实验操作[填图]

1．凝胶色谱法中移动速度快的是(

) A．相对分子质量大的

B．相对分子质量小的

C．溶解度高的 D．溶解度低的

解析：选A 凝胶色谱法是根据相对分子质量大小分离蛋白质的有效方法。当不同蛋白质通过凝胶时，相对分子质量小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量大的蛋白质无法进入凝胶内部通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。

2．下列各项中，不是电泳使样品中各种分子分离的原因的是(

) A．带电性质差异 B．分子的大小

C．分子的形状 D．分子的变性温度

解析：选D 电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。带电性质不同、分子的大小和形状不同都会影响带电粒子在电场中的迁移速度，而迁移速度与分子的变性温度无关。

3．蛋白质提取和分离的一般步骤是(

) ①样品处理

②凝胶色谱操作

③粗分离

④SDS­聚丙烯酰胺凝胶电泳

⑤纯化

⑥纯度鉴定

A．①②③④⑤⑥ B．①③⑤⑥

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C．③④⑤⑥ D．①③④⑤

解析：选B 蛋白质的提取和分离分为样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定四步。凝胶色谱操作及SDS­聚丙烯酰胺凝胶电泳为实验操作过程中的技术。

4．将经处理破裂后的红细胞混合液以2 000 r/min的速度

离心10 min后，离心管中的溶液分为四层，从上到下的顺序依次是(

) A．血红蛋白、

甲苯层、脂溶性物质层、沉淀层 B．甲苯层、沉淀层、血红蛋白、脂溶性物质层 C．脂溶性物质层、血红蛋白、甲苯层、沉淀层 D．甲苯层、脂溶性物质层、血红蛋白、沉淀层

解析：选D 混合液经离心后，按密度大小排列，在离心管中从上到下的顺序依次是：第1层为无色透明的甲苯层；第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质沉淀层；第3层为红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液；第4层为暗红色沉淀物，主要是红细胞破碎物沉淀。

核心要点一1．原理

根据蛋白质各种特性的差异分离蛋白质，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等。

| 蛋白质提取与分离的原理和方法

2．凝胶色谱法

凝胶色谱法又叫分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的方法：

蛋白质

项目

能否进入凝

相对分子质量大

不能进入

相对分子质量小

能进入

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胶内部

运动路径

运动方式

运动路程

运动速度

洗脱次序

3.电泳

(1)原理：

凝胶颗粒之间

垂直向下

较短

较快

先流出

凝胶颗粒内部

垂直向下和无规则扩散运动

较长

较慢

后流出

(2)常用方法：常用的电泳方法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。测定蛋白质分子量时通常使用SDS­聚丙烯酰胺凝胶电泳。在凝胶中加入SDS，可使蛋白质发生完全变性，解聚成单条肽链，然后与各种蛋白质形成蛋白质­SDS复合物，SDS所带负电荷的量远远超过了蛋白质分子原有电荷量，掩盖了不同蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。

[题组冲关] 1．相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的行进过程(见下图)可表示为(

)

解析：选B 用凝胶色谱法分离蛋白质时，相对分子质量较大的蛋白质迅速通过凝胶间隙，先被洗脱出来；相对分子质量较小的蛋白质进入凝胶内部而被滞留，后被洗脱出来。

2．关于电泳的说法，错误的是(

) A．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程

B．带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动

C．蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率只取决于它所带净电荷的多少

D．用SDS­聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电泳迁移率完全取决于分子的大小

解析：选C 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质­SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差异，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。

核心要点二

| 血红蛋白提取和分离的实验操作

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1．样品处理

(1)红细胞的洗涤

①目的：去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。

②过程：

(2)血红蛋白的释放

①目的：使红细胞破裂释放血红蛋白。

②过程：

a．将洗涤好的红细胞倒入烧杯中。

b．加蒸馏水到原血液的体积，其作用是使红细胞吸水涨破。

c．加入40%体积的甲苯，其作用是溶解细胞膜。

d．置于磁力搅拌器上充分搅拌10 min，其作用是加速红细胞破裂。

e．红细胞破裂，释放出血红蛋白。

(3)分离血红蛋白溶液

2．粗分离——透析

(1)目的：除去样品中相对分子质量较小的杂质。

(2)过程：取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300 mL物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液(pH为7.0)的烧杯中，透析12 h。

3．纯化——凝胶色谱操作

(1)凝胶色谱柱的制作

①取长40 cm，内径为1.6 cm的玻璃管，两端用砂纸磨平。

②柱底制作：打孔→挖凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。

③柱顶制作：打孔→安装玻璃管。

④组装：将上述三者按相应位置组装，并在下端出口连接带开关的尼龙管，尼龙管放入收集器。

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(2)凝胶色谱柱的装填

(3)样品的加入和洗脱

4．纯度鉴定

在鉴定的方法中，使用最多的是SDS­聚丙烯酰胺凝胶电泳。

5．结果分析与评价

项目

分析

分层明显→样品处理完成

血液样品的处理

凝胶色谱柱的装填

血红蛋白的分离

放一支与凝胶柱垂直的日光灯→直接检查(加入大分子有色物质，如蓝色葡聚糖－2 000或红色葡聚糖)→色带均匀、狭窄、平整→装填成功

血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随洗脱液缓慢流出→分离成功

[题组冲关] 3．下列有关“血红蛋白的提取和分离”实验的叙述，正确的是(

)

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A．用蒸馏水进行红细胞的洗涤，其目的是去除细胞表面的杂蛋白

B．将血红蛋白溶液进行透析，其目的是去除相对分子质量较大的杂质

C．血红蛋白释放时加入有机溶剂，其目的是使血红蛋白溶于有机溶剂

D．整个过程不断用磷酸缓冲液处理，是为了维持血红蛋白的结构

解析：选D 用生理盐水进行红细胞的洗涤，其目的是去除杂蛋白；将血红蛋白溶液进行透析，其目的是去除相对分子质量较小的杂质；血红蛋白释放时加入有机溶剂，其目的是使血红蛋白中的杂质溶于有机溶剂，以获得较为纯净的蛋白质。

4．如图为血红蛋白的提取和分离的部分实验装置，请回答下列问题：

(1)血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，其在红细胞中的作用体现了蛋白质具有___________________________________________________功能。

(2)甲装置中，B是血红蛋白溶液，则A是____________________________________；乙装置中，C溶液的作用是_______________________________________________。

(3)甲装置用于______，目的是_________________________________________。

用乙装置分离蛋白质的方法称为____________________，是根据_________________分离蛋白质的有效方法。

(4)用乙装置分离血红蛋白时，待_________________________________时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集。

(5)血红蛋白提取和分离的程序可分为四步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。其中样品处理包括__________________、____________________________、分离血红蛋白溶液。

解析：图甲为透析装置，图乙为样品的洗脱装置。(1)血红蛋白能运输氧气，体现了蛋白质的运输功能。(2)甲装置中用磷酸缓冲液来透析；乙装置中C溶液为磷酸缓冲液，其作用是洗脱蛋白质。(3)因透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内，故透析能去除样品中相对分子质量较小的杂质。乙装置是利用凝胶色谱法分离血红蛋白，它是根据蛋白质相对分子质量的大小来分离蛋白质的。(4)洗脱时先流出的是相对分子质量与血红蛋白相比较大的蛋白质，血红蛋白呈红色，故待红色的蛋白质接近色谱柱底端时就可用试管收集流出液。(5)样品处理包括红细胞的洗涤、血红蛋白的释放和分离血红蛋白溶液。

答案：(1)运输

(2)磷酸缓冲液

洗脱血红蛋白

(3)透析(粗分离) 去除样品中相对分子质量较小的杂质

凝胶色谱法

相对分子质量的大小

(4)红色的蛋白质接近色谱柱底端

(5)红细胞的洗涤

血红蛋白的释放

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