课题3　血红蛋白的提取和分离优质课一等奖

普通高中课程标准实验教科书——生物选修1[人教版] 课题3 血红蛋白的提取和分离（第一课时）

★教学目标

（一）知识与技能

1、尝试从血液中提取和分离血红蛋白

2、了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理

（二）过程与方法

体验血红蛋白提取和分离的实验的严格要求，注意按照操作提示进行相关步骤

（三）情感、态度与价值观

初步形成科学的思维方式，发展科学素养和人文精神

★教学重点

尝试从血液中提取和分离血红蛋白，凝胶色谱法的原理和方法

★教学难点

样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填

★教学方法

启发式教学

★教学工具

多媒体课件

★教学过程

（一）引入新课

蛋白质是生命活动的主要承担者，是细胞内含量最高的有机化和物。对蛋白质的研究有助于人们对生命过程的认识和理解。所以需要从细胞中提取蛋白质进行研究。怎样提取蛋白质呢？

（二）进行新课

1．实验设计

1.1蛋白质的提取和分离一般分为哪些基本步骤？

样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定。

1.2选择实验材料

用鸡的红细胞提取DNA，用猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？

鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取；哺乳动物成熟的红细胞无细胞核和细胞器，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。

（2）阅读教材或ppt，认识哺血红蛋白性质。并思考回答下列问题：

血红蛋白是由 和 构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的 基团。

1.3第一步：样品处理 样品处理分为：洗涤红细胞、释放血红蛋白、分离血红蛋白。

洗涤红细胞的目的是什么？

除去血浆蛋白的杂蛋白，有利于后续步骤的分离纯化。

红细胞的洗涤过程为：

血液＋柠檬酸钠→低速短时离心→吸出上层血浆→红细胞＋5倍体积生理盐水

→缓慢搅拌10min→低速短时离心→吸出上清液→反复洗涤直至上清液无黄色

思考：加入柠檬酸钠有何目的？为什么要低速、短时离心？为什么要缓慢搅拌？

防止血液凝固；防止白细胞沉淀；防止红细胞破裂释放出血红蛋白。

思考：你有什么方法将红细胞中的血红蛋白释放出来？

加入蒸馏水，用玻璃棒快速搅拌一段时间。

补充：加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。加入甲苯的目的是溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放和分离。此时，红细胞破碎混合液中不仅含有血红蛋白，而且还含有细胞破碎物、脂质、甲苯有机溶剂等。怎样除去这些杂质呢？由于它们的密度不同，科学家采取了离心分离的方法：

红细胞破碎混合液→中速长时离心（2000c/min×10min）→滤纸过滤除去脂质→分液漏斗分离出血红蛋白。

1.4第二步：粗分离

1.4.1方法：透析。

半透膜的选择透过性，大分子物质不能通过半透膜，离子和小分子能够通过半透膜。

在透析过程中，血红蛋白溶液中的离子和小分子不断通过半透膜扩散进入到pH＝7的磷酸缓冲液中。

1.4．2缓冲溶液

（1）原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H2CO3－NaHCO3，HC－NaC，NaH2PO4/Na2HPO4等），调节酸和盐的用量，可配制不同pH的缓冲液。

（2）缓冲液作用：抵制外界酸、碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。

思考：为何使用pH＝7的磷酸缓冲液？为什么缓冲液量远多于血红蛋白溶液量？

维持血红蛋白的正常特性。有利于杂质分子充分地向外扩散。

总结：通过以上过程，红细胞中的血红蛋白就被提取出来。但其中还含有其他种类的蛋白质分子（如呼吸酶等）。怎样将杂蛋白与血红蛋白分离开来呢？我们来研究蛋白质提取和分离的第三个步骤――纯化（凝胶色谱法）。

1．5第三步：纯化

1.5.1方法：凝胶色谱法（分配色谱法）

（1）原理：（图5－13a）分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。

（2）凝胶材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。

（3）分离过程：（教材图5－13b）

混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子

洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。

1．6第四步：纯度鉴定

方法：电泳

（1）原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。

（2）分离方法：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺经胶电泳等。

（3）分离过程：在一定pH下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的SDS，形成“蛋白质－SDS复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。

★巩固练习

1.凝胶色谱法是根据（

）分离蛋白质的有效方法。

A分子的大小

B相对分子质量的大小

C带电荷的多少

D溶解度

2．电泳是指带电粒子在电场的作用下向着与其所带电荷（

）的电极移动。

A相同

B相反

C相对

D相向

3.

哺乳动物和人的成熟的红细胞中的（

）与氧气的运输有关。

A血红蛋白

B肌红蛋白

C肌动蛋白

D肌球蛋白

4．为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂（

）。

A.

NaCl

B.甲苯

C.蒸馏水

D.柠檬酸钠

5．将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，可以明显看到试管中的溶液分为4层，

其中第3层是（

）

A无色透明的甲苯层

B脂溶性物质的沉淀层

C血红蛋白的水溶液

D其他杂质的暗红色沉淀物

6.下列是关于血红蛋白的提取和分离实验中关键步骤，其中正确的是（

）

A．蛋白质的提取和分离一般可分为粗分离、样品处理、纯化、纯度鉴定等4步

B．蛋白质的提取和分离实验可以以猪、牛、鸡、蛙等动物的血液为材料分离血红蛋白

C．对样品的处理过程分为红细胞的洗涤、血红蛋白的释放、透析和分离血红蛋白等

D．对蛋白质的纯化和纯度鉴定的方法使用最多的是SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳

7.蛋白质提取过程中有关透析的叙述，错误的是(

)

A．用于透析的薄膜要具有选择透过性

B．透析膜一般是用硝酸纤维素制成的

C．透析能使小分子自由出入，而将大分子保留在袋内

D．透析可用于更换样品的缓冲液

8.将经处理破裂后的红细胞混合液2000r/min的速度离心10min后，离心管中的溶液分为四层，从上到下顺序依次是(

) A．血红蛋白、甲苯层、其他杂质的暗红色沉淀物、脂溶性物质的沉淀层

B．甲苯层、脂溶性物质的沉淀层、血红蛋白、其他杂质的暗红色沉淀物

C．其他杂质的暗红色沉淀物、血红蛋白、甲苯层、脂溶性物质的沉淀层

D．甲苯层、其他杂质的暗红色沉淀物、血红蛋白、脂溶性物质的沉淀层

★课堂小结

你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？

样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定

1.样品的处理——通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液

2.样品的粗分离——经过透析去除分子量较小的杂质

3.样品的纯化——通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去

4.纯度鉴定——SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。

★课后作业

预习下一课时：凝胶色谱操作

★教学反思

本课题重在让学生了解生物科学在蛋白质领域的进展，说明提取、分离高纯度的蛋白质的重要性和必要性，并学习一些蛋白质分离和提取的基本技术。教师可以发挥学生的主动性，让学生介绍当前有关蛋白质研究的新进展，激发学生的学习兴趣，然后指出本课题的学习意义，让学生初步体会分离纯化蛋白质的过程和方法。