课题2　多聚酶链式反应扩增DNA片段优质课一等奖教案

课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段

【教学目标】

1、通过尝试PCR技术的基本操作，使学生体验PCR这一常规的分子生物学试验方法。

2、通过观看PCR相关视频,结合教师讲解,能够理解PCR的原理，讨论PCR的应用。

【教学重点】PCR的原理和PCR的基本操作。

【教学难点】PCR的原理。

【教学过程】

一、引入新课

在现代生物技术中，DNA技术可谓是尖端技术。人类基因组计划、基因工程、基因诊断、基因检测、古生物鉴定等都离不开对DNA分子碱基序列的分析。而分析DNA碱基序列，就需要一定量的DNA片段。怎样迅速获得足够量的DNA片段呢？ 今天我们来研究学习DNA分子的扩增技术――PCR技术。

二、进行新课

1.基础知识

PCR技术扩增DNA的过程，与细胞内DNA复制过程类似：

1.1 细胞内DNA复制条件分析：

条件

组分

作用

模板

DNA的两条单链

提供复制的模板

原料

四种脱氧核苷酸

合成DNA子链的原料

解旋酶

打开DNA双螺旋

酶

DNA聚合酶

催化合成DNA子链

能量

ATP 为解螺旋和合成子链供能

引物

RNA 为DNA聚合酶提供合成的3’端起点

1.2 细胞内DNA复制过程

（1）DNA的反向平行结构：

核苷酸分子的结构与方向性：（分子结构模式图）

由核苷酸通过3,5-磷酸二酯键连接形成核苷酸长链：（模式图，体现方向性）。DNA双螺旋结构的反向平行结构：

（2）DNA的复制过程: 解旋：解旋酶、ATP，DNA两条链打开，，形成两条DNA单链。

引物结合：在DNA单链3’端与DNA反向配对结合，确保引物3’端与DNA单链准确配对。

DNA聚合酶结合：

子链合成：DNA聚合酶从引物3’端开始，将配对的脱氧核苷酸连接起来。

后续加工：DNA聚合酶I将引物切去，并合成空缺处的DNA单链，再由DNA连接酶将不连续的DNA子链连接起来（半不连续合成。先导链，滞后链）

子链合成特点：不能从头合成；合成方向为“5’→3’合成”。

［思考］DNA分子能准确复制的原因有哪些？

DNA双螺旋结构提供模板；碱基互补配对；DNA聚合酶的复查功能。

1.3 DNA分子复制的人工控制

解开螺旋：在80～100℃时，DNA双螺旋打开，形成两条DNA单链，称为变性。

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恢复螺旋：在50℃左右时，两条DNA单链重新形成双螺旋结构，称为复性。

复制条件：缓冲液,DNA模板,四种脱氧核苷酸,热稳定DNA聚合酶,两种引物。

反应场所：PCR仪（自动温度周期性调节）。

［ 4.PCR的反应过程

变性

复性

延伸

变性：在95℃时DNA解旋

复性：在50℃时引物与DNA单链结合

延伸：在72℃时合成DNA子链（两个引物间的序列）

2.实验操作

2.1 PCR反应体系：缓冲液、DNA模板，四种脱氧核苷酸原料、热稳定DNA聚合酶、两种RNA引物，水

2.2 实验操作步骤

2.3 按照PCR反应体系配方配制反应液；

（1）将PCR反应体系50μL用微量移液器转移到微量离心管（0.5mL）中；

（2）将微量离心管放到PCR仪中；

（3）设置PCR仪的工作参数。

（4）DNA在PCR仪中大量扩增。

2.4 水浴法：将微型离心管依次在95℃、55℃、72℃的恒温水浴锅中循环处理相应时间。

3.实验注意事项

3.1 避免外源DNA污染：所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌。

3.2 缓冲液和酶分装成小份，－20℃低温保存。

3.3 每添加一种反应成分，更换一个移液器的枪头。

3.4 混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。

4.结果分析与评价

4.1 反应液稀释：取2µLPCR反应液，添加98µL蒸馏水；2.分光光度计调零：将100µL蒸馏水添加到比色杯中，在260nm处将分光光度计调整读数为零。

4.2 将100µL反应稀释液倒入比色杯中，测定在260nm处的光吸收值。

4.3 计算：DNA含量＝50×光吸收值×稀释倍数

【课堂小结】

多聚酶链式反应扩增DNAPCR原理

DNA的复制需要酶、原料、能量、引物

DNA的变性和复性受温度影响

变性

复性

延伸

移入离心管

放入PCR 计算

PCR过程

操作步骤

配制PCR反应体系

设置工作参数

调零

DNA扩增

测定含量

稀释

片段测定并读数

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【当堂检测】

1.在（ ）的温度范围内，DNA的双螺旋结构解开

A. 10－20℃ B. 80－100℃ C. 20－30℃ D. 40－60℃

2.下列有关PCR描述，不正确的是（ ）

A. 是一种酶促反应

B. 引物决定了扩增的特异性

C. 扩增产量按y＝（1＋X）n D. 扩增对象是氨基酸序列

E. 扩增对象是DNA序列

【教后反思】

教师在教学过程中，可以引导学生回忆必修2的有关DNA复制的知识，在此基础上，学生可加深对于PCR原理的认识。对于PCR反应过程的教学，应以读图识图为主。教材中反应过程图解详细的描绘了参与PCR的各种组成成分；每一轮反应的三个基本步骤—变性、复性、延伸；每一步骤的作用。教师在教学中可以请学生在读图的同时，结合教科书中的文字说明来加深理解。当学生遇到难以理解的地方时，教师要及时给予解答。

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