课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数名师教学视频（文字实录）

考点一

微生物的分离与培养

1.培养基

(1)概念：人们按照微生物对营养物质的不同需求，配制出供其生长繁殖的营养基质。

(2)营养组成：一般都含有水、碳源、氮源和无机盐。此外，还需要满足微生物生长对pH、氧气以及特殊营养物质的要求。

(3)种类：按照物理性质可分为液体培养基和固体培养基。

2.无菌技术

(1)含义：指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。

(2)关键：防止外来杂菌的入侵。

(3)不同对象的无菌操作方法(连线)

3.大肠杆菌的纯化培养

(1)制备牛肉膏蛋白胨固体培养基

①操作步骤

计算→称量→溶化→灭菌→倒平板

②倒平板的方法及注意事项

a.请用文字和箭头写出正确的倒平板操作流程：丙→乙→甲→丁。

b.甲、乙、丙中的灭菌方法是灼烧灭菌。

c.丁中的操作需要等待平板冷却凝固才能进行。

(2)纯化大肠杆菌的方法

①纯化培养原理：想方设法在培养基上得到由一个细菌繁殖而来的肉眼可见的菌落，即可获得较纯的菌种。

②纯化大肠杆菌的关键步骤是接种。

③常用的微生物接种方法有两种

a.平板划线法：是通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面。

b.稀释涂布平板法：是将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。

系列稀释操作(如下图所示)：

涂布平板操作(如下图所示)：

(3)菌种的保存方法

①对于频繁使用的菌种，可以采用临时保藏的方法。

②对于需要长期保存的菌种，可以采用甘油管藏的方法。

[诊断与思考]

1.判断下列说法的正误

(1)倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上(

×

)

(2)培养基分装到培养皿后进行灭菌(

×

) (3)从有机废水中分离分解有机物的微生物时，接种后的培养皿须放在光照培养箱中培养(

×

) (4)消毒的原则是既杀死材料表面的微生物，又减少消毒剂对细胞的伤害(

√

) (5)培养基一般都含有水、碳源、氮源和无机盐，有时还需要加入一些特殊的物质(

√

) (6)下图中甲为平板划线法中最重要的环节，乙为操作的结果：

①每一次划线后都要将接种环灼烧(

√

) ②除第一次划线外，每一次划线的起点都是第一次划线的末端(

×

) (7)用稀释涂布平板法纯化大肠杆菌时，只要稀释度足够高，就能在培养基表面形成单个菌落(

√

) 2.如图是采用纯化微生物培养的两种接种方法接种后培养的效果图，请思考：

(1)获得图A效果和B效果的接种方法分别是什么？

提示

获得效果A的接种方法为稀释涂布平板法，获得效果B的接种方法为平板划线法。

(2)某同学在纯化土壤中的细菌时，发现培养基上的菌落连成了一片，最可能的原因是什么？应当怎样操作才可避免此种现象？

提示

最可能的原因是菌液浓度过高或划线时在划下一区域前未将接种环灼烧灭菌；采取的措施是增大稀释倍数或每次划新区域前先将接种环灼烧灭菌。

题组一

培养基及其制备方法分析

1.下表为某培养基的配方，下列叙述正确的是(

) 成分

含量

A.从物理性质看该培养基属于液体培养基，从用途看该培养基属于选择培养基

B.该培养基中属于碳源的物质主要是葡萄糖，属于氮源的物质是蛋白胨

C.该培养基缺少提供生长因子的物质

D.该培养基调节合适的pH后就可以接种使用

蛋白胨

10 g 葡萄糖

10 g K2HPO4

2 g 伊红

0.4 g 美蓝

0.065 g 蒸馏水

1 000 mL

答案

B 解析

分析表中成分可知，该培养基中没有凝固剂，为液体培养基，该培养基的营养成分齐全，但存在伊红、美蓝等鉴别物质，属于鉴别培养基，A项错误；该培养基中的蛋白胨既是唯一的氮源，也是碳源，而葡萄糖是绝大多数生物最常利用的碳源，B项正确；该培养基中存在的无机盐和蛋白胨中的某些物质可以看作是生长因子，C项错误；培养基调节完pH还要进行灭菌等操作后，才能使用，D项错误。

2.高温淀粉酶在大规模工业生产中有很大的实用性。研究者从热泉中筛选出了能高效生产高温淀粉酶的嗜热菌，其筛选过程如下图所示。

(1)Ⅰ号培养基从物理状态来看，属于固体培养基，配制时要加入________作为凝固剂，从用途来看属于选择培养基，应以________作为唯一碳源。

(2)配置固体培养基的基本步骤是(

) A.计算、称量、倒平板、溶化、灭菌

B.计算、称量、溶化、倒平板、灭菌

C.计算、称量、溶化、灭菌、倒平板

D.计算、称量、灭菌、溶化、倒平板

(3)溶化时，烧杯中加入琼脂后要不停地________，防止琼脂糊底引起烧杯破裂。对培养基灭菌的方法一般为____________________。

(4)①过程是__________，②过程所使用的接种方法是________________法。

(5)部分嗜热菌在Ⅰ号培养基上生长时可释放________分解培养基中的淀粉，在菌落周围形成透明圈，挑选相应的菌落，接种到Ⅱ号培养基进一步分离纯化后，再对菌种进行_______培养。

答案

(1)琼脂

淀粉

(2)C

(3)搅拌

高压蒸气灭菌

(4)稀释

涂布分离

(5)淀粉酶

扩大

解析

固体培养基通常加入琼脂作为凝固剂。本实验的目的是获得产生高温淀粉酶的嗜热菌，故其选择培养基中应以淀粉作为唯一碳源。配置固体培养基的基本步骤是计算、称量、溶化、灭菌、倒平板。配置培养基时加热溶化时，要注意加入琼脂后要不断搅拌，防止琼脂糊底和溢出。对培养基的灭菌一般采用高压蒸汽灭菌。仔细观察题图可知，过程①是菌液稀释，过程②是采用涂布法接种的。能产生淀粉酶的部分细菌能分解利用淀粉，其菌落周围会出现透

明圈，取这样的菌落再分离纯化可获得相应菌种，以后可以扩大培养用于生产。

题组二

无菌技术的操作

3.微生物培养过程中，要十分重视无菌操作。现代生物学实验中的许多方面也要进行无菌操作，防止杂菌污染。请分析下列操作中错误的是(

) ①煮沸消毒可以杀死微生物的营养细胞和部分芽孢

②接种操作要在酒精灯火焰附近进行

③无菌繁殖脱毒苗时，植物的外植体要进行消毒

④家庭制作葡萄酒时要将容器和葡萄进行灭菌

⑤培养基要进行高压蒸汽灭菌

⑥加入培养基中的指示剂和染料不需要灭菌

A.①③

B.②④

C.③⑤

D.④⑥

答案

D 解析

无菌操作包括消毒和灭菌。需进行消毒处理的有植物的外植体及操作人员的双手等，需进行灭菌的有器皿、培养基、添加剂(指示剂或染色剂)等。煮沸可以杀死微生物的营养细胞和一部分芽孢，属于消毒；为防止空气中杂菌污染，接种时要在酒精灯火焰附近进行；家庭制作葡萄酒时所利用的微生物是葡萄表面的酵母菌，故不能灭菌；培养基常进行高压蒸汽灭菌。故④⑥操作错误。

4.细菌培养过程中分别采用了高压蒸汽、酒精、火焰灼烧等几种不同的处理，这些方法依次用于杀灭哪些部位的杂菌(

) A.接种环、手、培养基

C.培养基、手、接种环

答案

C 解析

灭菌是指彻底杀灭微生物使其永远丧失生长繁殖的能力，对于培养基、操作器皿和接种环等都需要灭菌。消毒仅指杀死物体表面或内部一部分对人体有害的病原菌而对被消毒的物体基本无害，如操作者的手和衣着需要消毒处理。高压蒸汽通常用于培养基的灭菌。用酒精擦拭双手是消毒的一种方法。火焰灼烧可以迅速彻底地灭菌，适用于微生物的接种工具，如接种环。

题组三

大肠杆菌的纯化方法及过程分析

5.下图中甲是稀释涂布平板法中的部分操作，乙是平板划线法的操作结果。

B.高压锅、手、接种环

D.接种环、手、高压锅

下列叙述中错误的是(

) A.甲中涂布前要将涂布器灼烧，冷却后才能取菌液

B.对于浓度较高的菌液，如甲中的稀释倍数仅为102，则所得的菌落不一定是由单一的细胞或孢子繁殖而成

C.乙培养皿中所得的菌落都符合要求

D.乙中的连续划线的起点是上一次划线的末端

答案

C 解析

灼烧后的涂布器如果没有冷却就接触菌种，会将菌体杀死，A正确。稀释倍数过低会导致多个菌体聚集在一起繁殖成菌落，B正确。平板划线法中最后一次划线的末端处形成的菌落才是由单一的细胞或孢子繁殖而成，这种菌落才符合要求，C错误。连续划线中，除了第一次划线外，每一次划线的起点是上一次划线的末端，目的是使得菌体密度越来越小，保证最后划线末端处的菌落是由单一的细胞或孢子繁殖而成。

6.下图甲、乙是微生物接种常用的两种方法，请回答相关问题。

(1)图甲是利用________法进行微生物接种，图乙是利用__________________法进行微生物接种。这两种方法所用的接种工具分别是________和________；对这两种接种工具进行灭菌和消毒的方法依次是________和酒精消毒。

(2)接种操作为什么一定要在火焰附近进行？

________________________________________________________________________。

(3)接种后，在固体培养基上培养细菌时为什么进行倒置培养？

________________________________________________________________________。

(4)如图是采用上述接种方法接种后培养的效果图解，其接种方法是________(填“图甲”或“图乙”)。

答案

(1)平板划线

稀释涂布平板

接种环

涂布器

灼烧灭菌

(2)火焰附近存在着无菌区域

(3)避免培养过程产生的水分影响微生物的生长

(4)图乙

解析

图甲和图乙分别是平板划线法和稀释涂布平板法，这两种方法所用的接种工具分别是接种环和涂布器。由于在酒精灯火焰附近存在着无菌区域，因此接种常在火焰附近进行。在微生物培养过程中会产生水，对微生物的生长造成影响，故需要倒置培养。

1.培养基的配制原则

(1)目的要明确：配制时应根据微生物的种类、培养目的等确定配制的培养基种类。

(2)营养要协调：注意各种营养物质的浓度和比例。

(3)pH要适宜：细菌为6.5～7.5，放线菌为7.5～8.5，真菌为5.0～6.0，培养不同微生物所需pH不同。

2.微生物对主要营养物质的需求特点

不同种类的微生物代谢特点不同，因此对培养基中营养物质的需求也不同。

(1)自养型微生物所需的主要营养物质是无机盐，碳源可来自大气中的CO2，氮源可由含氮无机盐提供。

(2)异养型微生物所需的营养物质主要是有机物，即碳源必须由含碳有机物提供，氮源也主要是由有机物提供，部分异养型微生物也可以利用无机氮源。

3.消毒和灭菌的辨析

项目

条件

较为温和的消毒

物理或化学方法

结果

仅杀死物体表面或内部的部分对人体有害的微生物

常用方法

煮沸消毒法

巴氏消毒法

化学药剂消毒法

灼烧灭菌法

灭菌

强烈的理化因素

杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子

干热灭菌法

高压蒸汽灭菌法

应用范围

日常用品

不耐高温的液体

用酒精擦拭双手，用氯气消毒水源

接种工具

玻璃器皿、金属工具

培养基及容器的灭菌

4.两种纯化细菌方法的比较

项目

平板划线法

优点

可以观察菌落特征，对混合菌进行分离

缺点

不能计数

吸收量较少，较稀释涂布平板法

可以计数，可以观察菌落特征

麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延

适用于厌氧菌和兼性厌氧菌

适用范围

适用于好氧菌

考点二

微生物的筛选和计数

1.土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

(1)分离原理：土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起到催化作用。

(2)统计菌落数目：统计样品中的活菌一般用稀释涂布平板法。

(3)实验流程：土壤取样→样品的稀释→微生物的培养与观察→细菌的计数。

2.分解纤维素的微生物的分离

(1)纤维素酶

①组成：纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。

②作用

纤维素――→纤维二糖―――――→葡萄糖

C酶XC1酶葡萄糖苷酶(2)纤维素分解菌的筛选

①原理

纤维素分解菌

↓

刚果红纤维素酶→红色复合物――→红色消失，出现透明圈

纤维素②筛选方法：刚果红染色法，即通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

③培养基：以纤维素为唯一碳源的选择培养基。

④实验流程

土壤取样：富含纤维素的环境

↓

选择培养：用选择培养基培养，以增加纤维素分解菌的浓度

↓

梯度稀释：制备系列稀释液

↓

涂布平板：将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上

↓

挑选产生透明圈的菌落

[诊断与思考]

1.判断下列说法的正误

(1)选择培养基可以鉴定某种微生物的种类(

×

) (2)从物理性状的角度看，选择培养基多属于固体培养基(

√

) (3)对细菌进行计数只能采用稀释涂布平板法，而不能用平板划线法(

×

) (4)筛选能分解尿素的细菌所利用的培养基中，尿素是唯一的氮源(

√

) (5)分解尿素的细菌在分解尿素时，可以将尿素转化为氨，使得培养基的酸碱度降低(

×

) (6)纤维素是构成植物细胞壁的主要成分，在纤维素酶的作用下，纤维素可以水解成葡萄糖(

√

) (7)刚果红可以与纤维素形成透明复合物，所以可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌(

×

) (8)在筛选能分解纤维素的细菌的实验中，选择培养的目的是增大样品中目的菌株的浓度(

√

) (9)刚果红染色法只能在培养微生物的时候加入刚果红(

×

) 2.一种自养微生物与多种异养微生物混合在一起，如何将自养微生物选择出来？

提示

用不含有机碳的培养基进行培养，因为自养微生物可以利用空气中的CO2而异养微生物不可以，所以能在培养基中生存的就是自养微生物。

3.2013年11月22日凌晨3点，青岛黄岛区发生石油泄漏事件，一些微生物可以有效地分解石油，如何配制选择培养基将这类微生物选择出来？

提示

配制的选择培养基中，石油作为唯一的碳源，然后用这种培养基培养多种微生物，凡是能在该种培养基上生存的就是能分解石油的微生物。

4.为什么测定活菌的数量不能用平板划线法？

提示

由于在所划的线中，一般只有最后一次划线的末端才会形成只由一个细菌形成的菌落，而其他一些菌落往往由两个细菌或多个细菌繁殖而成，而在计数时一个菌落对应着一个细菌，这样在划线所得的平板中，菌落数目低于活菌的实际数值，所以不能用平板划线法测定活菌数量。

5.在分离纤维素分解菌的操作中，选择培养和鉴别培养的目的分别是什么？从物理性质的角度看，两种培养基分别是哪种培养基？

提示

选择培养的目的是增大纤维素分解菌在样品中的浓度，鉴别培养的目的是筛选出纤维素分解菌。选择培养的培养基中没有加入琼脂，所以属于液体培养基，而鉴别培养基属于固体培养基。

题组一

选择培养基成分及配制方法的分析

1.选择培养基是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理、化学抗性而设计的培养基。利用这种培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。为选择酵母菌和硝化细菌，应选用的培养基分别为(

) A.伊红美蓝培养基、含青霉素培养基

B.含青霉素培养基、含氨的无机培养基

C.含氨的无机培养基、含青霉素培养基

D.含青霉素培养基、伊红美蓝培养基

答案

B 解析

酵母菌是真菌，通常可以用含青霉素的培养基进行选择培养，因为青霉素抑制细菌生长，但不能抑制真菌生长。硝化细菌为自养型生物，能够利用氨转变为亚硝酸和硝酸所释放的能量，把无机物转变为有机物以维持自身生命活动，利用含氨的无机培养基可进行选择培养。

2.苯酚是工业生产排放的有毒污染物质，自然界中存在着降解苯酚的微生物。某工厂产生的废水中含有苯酚，为了降解废水中的苯酚，研究人员从土壤中筛选获得了只能降解利用苯酚的细菌菌株，筛选的主要步骤如图所示，①为土壤样品。请回答下列问题：

(1)②中培养目的菌株的选择培养基中应加入________作为碳源，②中不同浓度碳源的培养基________(A.影响；B.不影响)细菌的数量，如果要测定②中活细菌数量，常采用____________________法。

(2)④为对照，微生物在④中不生长，在⑤中生长，④与⑤培养基的主要区别在于

________________________________________________________________________；

使用______________________________法可以在⑥上获得单菌落。采用固体平板培养细菌时进行倒置培养的原因是__________________________________________________________ ______________________________________________________________________________。

(3)实验过程中如何防止其他微生物的污染？

________________________________________________________________________。

答案

(1)苯酚

A

稀释涂布平板

(2)④的培养基没有加入苯酚作为碳源，⑤的培养基加入了苯酚作为碳源

稀释涂布平板法或平板划线

防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基

(3)培养基灭菌，接种环境灭菌，接种过程进行无菌操作

解析

根据微生物对营养的需求，在培养基中加入或不加某些物质以达到促进目的菌生长，抑制或阻止其他杂菌生长的目的，然后再用稀释涂布平板法、平板划线法或其他方法筛选出单个目的菌落，再接种培养即可获得纯目的菌。为防止培养基中水分蒸发形成的水珠落入培养基中影响菌体生长，所以要将培养皿倒置。在设计实验中要注意单一变量原则和对照原则，操作中要严格进行无菌操作。

题组二

土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

3.下表是某同学列出的分离土壤中微生物培养基的配方，据此回答下列问题：

培养基配方

KH2PO4

Na2HPO4

MgSO4·7H2O 葡萄糖

尿素

琼脂

1.4 g 2.1 g 0.2 g 10.0 g 1.0 g 15.0 g

将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL

(1)从作用上看，该培养基属于________培养基，提供氮源的物质是________，细菌能利用该氮源是由于体内能合成________酶。

(2)在对分离的能分解尿素的细菌进行鉴定时，还需在培养基中加入________指示剂，若指示剂变________，说明有目的菌株存在。

(3)为了测定微生物的数量，接种时应采用__________________法，某同学在4个培养基上分别接种稀释倍数为106的土壤样液0.1 mL，培养后菌落数分别为180、155、176、129个，则每毫升原土壤样液中上述微生物的数量为________，测定的活菌数比实际活菌数________(填“低”“高”“基本一致”)。

答案

(1)选择

尿素

脲(催化尿素分解的) (2)酚红

红

(3)稀释涂布平板

1.6×109

低

解析

(1)题干指出表中是分离土壤中微生物的培养基配方，其中尿素是唯一氮源，能生长的

菌落说明能利用尿素中的氮源，所以甲从用途上属于选择培养基。以尿素为唯一氮源的培养基可以选择尿素分解菌。(2)在对分离的能分解尿素的细菌进行鉴定时，还需在培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变红，说明有目的菌株存在。(3)纯化微生物可以用稀释涂布平板法和平板划线法，其中稀释涂布平板法能用于微生物的计数。1 mL原土壤样液中上述微生物数量＝(180＋155＋176＋129)÷4×106×10＝1.6×109个；用稀释涂布平板法进行微生物的计数，但统计的数量比实际数量会偏少，原因是当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。

题组三

分解纤维素的微生物的分离

4.植物秸秆中的纤维素可被某些微生物分解。回答下列相关问题：

(1)分解秸秆中纤维素的微生物能分泌纤维素酶，该酶是由3种组分形成的复合酶，其中的葡萄糖苷酶可将______________分解成______________。

(2)在含纤维素的培养基中加入刚果红(CR)染料时，CR可与纤维素形成________色复合物。用含有CR的该种培养基培养纤维素分解菌时，培养基上会出现以该菌的菌落为中心的________。

(3)为从富含纤维素分解菌的土壤中分离获得纤维素分解菌的单菌落并加以鉴定，某同学设计了甲、乙两种培养基：

培养基甲

培养基乙

注：“＋”表示“有”，“－”表示“无”。

据表判断，培养基甲________(填“能”或“不能”)用于分离纤维素分解菌，原因是__________________________________________；培养基乙________(填“能”或“不能”)用于鉴定纤维素分解菌，原因是__________________________________________。

答案

(1)纤维二糖

葡萄糖

(2)红

透明圈

(3)不能

液体培养基不能分离单菌落

不能

培养基中没有纤维素(不能形成CR－纤维素红色复合物) 解析

(1)葡萄糖苷酶可将纤维二糖分解成葡萄糖。(2)刚果红与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，红色复合物无法形成，出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。(3)纤维素分解菌分离和鉴别培养基属于固体培养基，而培养基甲中没有琼脂，是液体培养基，要分离和鉴别纤维素分解菌，

需要以纤维素为唯一碳源的培养基，

培养基乙没有纤维素，不能形成CR－纤维素红色复合物，无法鉴定纤维素分解菌。酵母膏

＋

＋

无机盐

＋

＋

淀粉

－

＋

纤维素粉

＋

－

琼脂

－

＋

CR溶液

＋

＋

水

＋

＋

1.选择培养基的制作方法

(1)在培养基全部营养成分具备的前提下，加入物质：依据某些微生物对某些物质的抗性，在培养基中加入某些物质，以抑制不需要的微生物，促进所需要的微生物生长，如培养基中加入高浓度食盐时可抑制多种细菌的生长，但不影响金黄色葡萄球菌的生长，从而可将该菌分离出来；而在培养基中加入青霉素时可抑制细菌、放线菌的生长，从而分离得到酵母菌和霉菌。

(2)通过改变培养基的营养成分达到分离微生物的目的：培养基中缺乏氮源时，可分离自生固氮微生物，非自生固氮微生物因缺乏氮源而无法生存；培养基中若缺乏有机碳源则异养微生物无法生存，而自养微生物可利用空气中的CO2制造有机物生存。

(3)利用培养基的特定化学成分分离特定微生物：如当石油是唯一碳源时，可抑制不能利用石油的微生物的生长，使能够利用石油的微生物生存，从而分离出能消除石油污染的微生物。

(4)通过某些特殊环境分离微生物：如在高盐环境中可分离耐盐菌，其他菌在盐浓度高时易失水而不能生存；在高温环境中可分离得到耐高温的微生物，其他微生物在高温环境中因酶失活而无法生存。

2.稀释涂布平板法计数微生物的注意问题

用稀释涂布平板法计数微生物时，要求选择菌落数在30～300的平板进行计数。解题时易出现以下误解：

(1)只得到1个菌落数在30～300的平板是错误的。错误的原因是不符合实验的重复原则，易受到偶发因素的影响。

(2)得到3个或3个以上菌落数在30～300的平板，也不一定正确，这可能有两种情况：

①不同平板间差异较大，如得到3个平板，菌落数分别为230、34、240，虽然菌落数均在“30～300”之间，这也是不正确的，因为“34”与“230”“240”差异太大，应重新实验找出原因。

②不同平板之间差异不大，是符合要求的，用其平均值作为估算的最终结果。

可见，并不是只要得到3个“菌落数在30～300的平板”即可，而应该是涂布的同一稀释度的平板均符合“菌落数在30～300的平板”且无较大差异，说明实验操作合格，才能按照计算公式进行计算。

3.两种微生物筛选方法的比较

项目

方法

土壤中分解尿素的细菌的分离

使用以尿素为唯一氮源的选择培养基进行培养

土壤中不能分解尿素的微生物因缺乏脲酶而不能正常生长，能够分分解纤维素的微生物的分离

利用富含纤维素的选择培养基进行培养

因为培养基中含有丰富的纤维素，因此能够分解纤维素的微生物具原理

解尿素的微生物能利用尿素为氮源正常生长，从而起到选择作用

特有

代表

过程

CO(NH2)2＋H2O――→CO2＋2NH3

脲酶有更多的生存机会而大量繁殖

纤维素――→

纤维二糖――→葡萄糖

葡萄糖苷酶C1酶、CX酶知识网络

答题语句

网络构建

要语强记

1.无菌操作技术包括消毒和灭菌，消毒包括煮沸消毒、巴氏消毒、化学药剂消毒和紫外线消毒等；灭菌包括灼烧灭菌、干热灭菌和高压蒸汽灭菌。

2.培养基的制备包括计算、称量、溶化、灭菌、倒平板等步骤，倒置平板的目的是防止培养皿盖上的水滴滴入培养基造成污染。

3.大肠杆菌的纯化包括平板划线法和稀释涂布平板法。平板划线法要求多次划线，稀释涂布平板法要求菌液要充分地稀释。

4.微生物的计数要求制作多个平板，且每个平板上能长出30～300个菌落。

5.尿素分解菌和纤维素分解菌的分离都运用了选择培养基，前者所用的培养基中尿素是唯一的氮源，后者所用的培养基中纤维素是唯一的碳源。

探究高考

明确考向

1.(2015·江苏，19)做“微生物的分离与培养”实验时，下列叙述正确的是(

) A.高压灭菌加热结束时，打开放气阀使压力表指针回到零后，开启锅盖

B.倒平板时，应将打开的皿盖放到一边，以免培养基溅到皿盖上

C.为了防止污染，接种环经火焰灭菌后应趁热快速挑取菌落

D.用记号笔标记培养皿中菌落时，应标记在皿底上

答案

D

解析

A项错，高压灭菌加热结束后，让其自然冷却，待压力表的压力降到零时，再慢慢打开排气阀以排除余气，然后才能开盖取物；B项错，倒平板时左手拿培养皿，右手拿锥形瓶，左手将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，倒入培养基后立即盖上培养皿皿盖；C项错，灼烧接种环之后，要在火焰旁冷却后才能伸入菌液，以免温度太高杀死菌种；D项对，在微生物的培养中，一般将培养皿倒置，在皿底上用记号笔做标记。

2.(2013·江苏，18)某研究小组从有机废水中分离微生物用于废水处理。下列叙述正确的是(

) A.培养基分装到培养皿后进行灭菌

B.转换划线角度后需灼烧接种环再进行划线

C.接种后的培养皿须放在光照培养箱中培养

D.培养过程中每隔一周观察一次

答案

B 解析

培养基灭菌后再分装到培养皿中；转换划线角度后要灼烧接种环，冷却后再从上次划线的末端开始进行划线；接种后的培养皿必须放在恒温箱中进行培养，一般每隔12 h或24 h观察一次。

3.(2012·北京，5)高中生物学实验中，在接种时不进行严格无菌操作对实验结果影响最大的一项是(

) A.将少许干酵母加入到新鲜的葡萄汁中

B.将毛霉菌液接种在切成小块的鲜豆腐上

C.将转基因植物叶片接种到无菌培养基上

D.将土壤浸出液涂布在无菌的选择培养基上

答案

C 解析

在酿制葡萄酒的过程中，如果灭菌不彻底会影响葡萄酒的品质，但影响不大；在制作腐乳的过程中，发酵过程有多种微生物的参与，所以该过程不进行严格的无

菌操作对结果影响不大；在植物组织培养过程中，如果灭菌不彻底，杂菌产生的物质会影响外植体的生长，甚至杀死外植体，导致培养失败，对结果影响最大；土壤浸出液本身就含有大量的杂菌，另外在选择培养基上只能生存我们所要筛选的细菌，所以无菌操作不严格，对结果影响也不会太大。

4.(2015·全国Ⅰ，39)已知微生物A可以产生油脂，微生物B可以产生脂肪酶。脂肪酶和油脂可用于生物柴油的生产。回答有关问题：

(1)显微观察时，微生物A菌体中的油脂通常可用______________染色。微生物A产生的油脂不易挥发，可选用________(填“萃取法”或“水蒸气蒸馏法”)从菌体中提取。

(2)为了从自然界中获得能产生脂肪酶的微生物B的单菌落，可从含有油料作物种子腐烂物的土壤中取样，并应选用以________为碳源的固体培养基进行培养。

(3)若要测定培养液中微生物B的菌体数，可在显微镜下用____________________直接计数；若要测定其活菌数量，可选用____________________法进行计数。

(4)为了确定微生物B产生的脂肪酶的最适温度，某同学测得相同时间内，在35 ℃、40 ℃、45 ℃温度下降解10 g油脂所需酶量依次为4 mg、1 mg、6 mg，则上述三个温度中，________ ℃条件下该酶活力最小。为了进一步确定该酶的最适温度，应围绕________ ℃设计后续实验。

答案

(1)苏丹Ⅲ(或苏丹Ⅳ)

萃取法

(2)油脂

(3)血细胞计数板

稀释涂布平板

(4)45

40 解析

(1)生物组织中的油脂能被苏丹Ⅲ(或苏丹Ⅳ)染成橘黄色(或红色)。(2)为了筛选出能产生脂肪酶的微生物B的单菌落，我们应选用只能让该菌落生长的选择性培养基，因此培养基中只能选用油脂作为唯一碳源的固体培养基。(3)血细胞计数板可用于直接计数培养液中的菌体数，但是不分死活，因此要计数活菌数量要通过稀释涂布平板法来计数。(4)温度影响酶的活性，在三个温度中，45 ℃需酶量最高，说明酶活性最低；在三个温度实验中40 ℃所需酶量最少，低于35 ℃和45 ℃所用酶量，说明酶的最适温度介于35 ℃和45 ℃之间，因此应围绕40 ℃设计不同温度梯度，进行后续实验。

练出高分

1.下列关于微生物的分离和培养的叙述中，正确的是(

) A.进行微生物培养前，需对培养瓶进行消毒处理

B.对细菌的分离和计数可用平板划线法和稀释涂布平板法

C.获得纯净培养物的关键是防止杂菌污染

D.用含刚果红的尿素培养基筛选鉴别出能分解尿素的菌株

答案

C 解析

选项A，应对培养瓶进行灭菌处理。选项B，对细菌进行计数时不能用平板划线法。选项D，用含酚红的尿素培养基筛选和鉴别出分解尿素的菌株。

2.用来判断选择培养基是否起到了选择作用需要设置的对照是(

) A.未接种的选择培养基

B.未接种的牛肉膏蛋白胨培养基

C.接种了的选择培养基

D.接种了的牛肉膏蛋白胨培养基

答案

D 解析

选择的目的是为了分离、筛选，对照遵循的原则是单一变量，因此用接种了的普通培养基和选择培养基进行对照，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目。

3.在农田土壤的表层自生固氮菌较多，用表层土制成的稀泥浆接种到特制的培养基上培养，可将自生固氮菌与其他细菌分开，对培养基的要求是(

)

①加抗生素

②不加抗生素

③加氮素

④不加氮素

⑤加葡萄糖

⑥不加葡萄糖

⑦37 ℃恒温箱中培养

⑧28～30 ℃温度下培养

A.①③⑤⑦

C.②④⑤⑧

答案

C 解析

细菌对抗生素敏感，故培养基中应不加抗生素；自生固氮菌有固氮功能，故培养基中不需要加氮素；自生固氮菌是异养的，故培养基中应该加葡萄糖；其生长繁殖的适宜温度是28～30 ℃。

4.下面关于土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的叙述中，正确的是(

) A.只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素

B.筛选分解尿素的细菌时应以尿素作为培养基中的唯一营养物质

C.统计样品中的活菌数目时一般用平板划线法

D.在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，若指示剂变蓝，则表明筛选到了分解尿素的细菌

答案

A 解析

只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，A正确；筛选分解尿素的细菌的实验中，采用的是以尿素为唯一“氮源”的培养基，B错误；统计样品中的活菌数目一般用稀释涂布平板法，C错误；在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养某种细菌后，如果pH升高，指示剂变红，这样就能初步鉴定该种细菌能够分解尿素，D错误。

5.下列关于微生物接种的描述，正确的是(

) A.平板划线法只用于固体培养基的接种，而稀释涂布平板法只用于液体培养基的接种

B.平板划线法不能用于微生物的计数，而稀释涂布平板法可用于微生物的计数

C.利用平板划线法不能得到单菌落，而利用稀释涂布平板法能得到单菌落

D.平板划线法所用的接种工具不需要灭菌，而稀释涂布平板法所用的接种工具需要灭菌

答案

B 解析

这两种接种方法都可用于固体培养基的接种，都能用于形成单菌落，接种器具都要进行严格灭菌处理，A、C、D错误。

6.分离土壤中分解尿素的细菌，对培养基的要求是(

) 选项

A B C D 尿素

＋

－

＋

＋

琼脂糖

＋

－

＋

－

葡萄糖

＋

－

＋

－

硝酸盐

＋

－

－

＋

B.②④⑥⑧

D.①④⑥⑦

注：“＋”表示加入，“－”表示未加入。

答案

C 解析

分离土壤中分解尿素的细菌，培养基中要有碳源，且尿素作为唯一的氮源，不能添加硝酸盐。

7.下列培养基配方中能作为选择培养基、鉴别培养基的依次是(

) 原料

蛋白胨(g) 乳糖(g) 蔗糖(g) KH2PO4(g) 伊红(g) 美蓝(g) 琼脂(g) NaCl(g) 蒸馏水(mL)

A.①③

C.②④

答案

D 解析

在培养基中加入伊红和美蓝，可以用来鉴别饮用水和乳制品中是否存在大肠杆菌，有伊红和美蓝的培养基为鉴别培养基。高浓度的食盐可以抑制多种细菌的生长，但不影响金黄色葡萄球菌的生长，从而可以将金黄色葡萄球菌分离出来，有高浓度食盐的培养基为选择培养基。

8.下列关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述中，不正确的是(

) A.用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高压蒸汽灭菌后倒平板

B.取104、105、106倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL涂布到不同平板上培养

C.将实验组和对照组平板倒置，37 ℃恒温培养24～48小时

D.确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的平板进行计数

答案

D 解析

制备培养基时，需要将培养基用高压蒸汽灭菌，A正确；接种方法为稀释涂布平板法，即需要制备不同的土壤稀释液，B正确；对照组和实验组需要放置在恒温培养箱中培养，C正确；一般选择菌落数在30～300间的平板进行计数，D错误。

9.下面从土壤中筛选纤维素分解菌的实验步骤，正确的是(

) ①土壤取样

B.②①

D.③①

①

10 5 5 2 0.4 0.065 10

1 000 ②

10 5 5 2

20

1 000 ③

10 5 5 2

20 1 000 ④

10 5 5 2

1 000

②称取10 g土壤加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中

③吸取0.1 mL进行平板涂布

④依次稀释至101、102、103、104、105、106、107稀释度

A.①→②→③→④

C.①→②→④→③

答案

C 解析

在分离土壤中某细菌时，应先选取土样(10 g)，然后加无菌水获得土壤浸出液，并进行不同倍数稀释，最后将稀释液涂布到培养基表面进行培养，并分离和计数。

10.以下有关生物技术实践的叙述中，不正确的是(

) A.在大肠杆菌的分离和培养实验中，划线后盖好培养皿，再将培养皿倒置培养

B.在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌，符合生物与环境相适应的生物学观点

C.在酿酒生产上，常向发酵罐中加少量尿素，其目的是作为氮源，用于酵母菌合成蛋白质和核酸

D.不能用稀释涂布平板法来测定土壤溶液中某活菌数目

答案

D 11.在农业生产研究上，常需要进行微生物的分离和计数。

(1)下表为两种微生物的培养基配方：

A组

KH2PO4

1.4 g B组

纤维素粉

5 g

注：上述两种培养基中的物质溶解后，均用蒸馏水定容至1 000 mL。

①从功能上来看，上述两种培养基均属于____________培养基。

②如果要对土壤中分解尿素的细菌进行分离，则需要选择________培养基(填“A”或“B”)，该培养基中的碳源是________________。

③在分离尿素分解菌所用的培养基中可加入________指示剂，根据指示剂的颜色可鉴定某种细菌能否分解尿素，若有分解尿素的细菌，培养基将会呈现__________。

(2)下图是某同学采用的接种微生物的方法，请回答下列问题：

NaNO3

1 g Na2HPO4·

7H2O 1.2 g KH2PO4

0.9 g MgSO4·

7H2O 0.5 g KCl 0.5 g 酵母膏

0.5 g 水解

酪素

0.5 g Na2HPO4

2.1 g MgSO4·7H2O 0.2 g 葡萄糖

10.0 g 尿素

1.0 g 琼脂

15.0 g B.①→③→②→④

D.①→④→②→③

①本实验采用的接种微生物的方法是______________法，把聚集的菌种逐步__________分散到培养基的表面，为达到这一目的，操作上应注意：_____________________(至少答2项)。

②三位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中细菌数量，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下统计结果：

甲同学涂布了两个平板，统计的菌落数是236和260，取平均值248；

乙同学涂布了三个平板，统计的菌落数是210、240和250，取平均值233；

丙同学涂布了三个平板，统计的菌落数是21、212和256，取平均值163；

在三位同学的统计中，________同学的统计是正确的。

答案

(1)①选择

②A

葡萄糖

③酚红

红色

(2)①平板划线

稀释

每次划线前接种环要灼烧；冷却后从上一次划线的末端开始划线

②乙

解析

(1)①据题表中的培养基的配方分析，A组中的氮源为尿素，应该是筛选尿素分解菌的选择培养基。B组中的碳源是纤维素，应该是筛选纤维素分解菌的选择培养基。②对土壤中分解尿素的细菌进行分离，需要使用以尿素为唯一氮源的选择培养基，应当选择A组培养基，该培养基中的碳源是葡萄糖。③尿素分解菌可以用酚红指示剂进行鉴定。尿素分解菌产生的脲酶能够将尿素分解为氨而使pH升高，使酚红指示剂呈红色。(2)①据图分析，图示表示平板划线法接种，是把聚集的菌种逐步稀释到培养基的表面，操作上应注意每次划线前接种环要灼烧；冷却后从上一次划线的末端开始划线。②在进行平板菌落计数时，应选择菌落数在30～300之间的平板进行计数，同时为避免误差应选择至少3个或3个以上的平板进行计数并取平均值。

12.炭疽病是由炭疽杆菌引起的一种人畜共患传染病，炭疽杆菌两端截平、呈竹节状排列，菌落呈卷发状，对炭疽病疑似患者，可根据噬菌体的宿主专一性，通过实验确诊。

①细菌培养：采集疑似患者的样本，分离培养，获得可疑菌落。

②细菌鉴定：实验流程如图所示。

(1)挑选可疑菌落制片后，用____________观察，可看到呈竹节状排列的杆菌。

(2)对配制的液体培养基等需采取____________灭菌；实验所用液体培养基的碳源为

________________(填“无机碳”或“有机碳”)。

(3)接种可疑菌落后，35 ℃培养24 h，液体培养基变混浊，原因是__________________。对照组试管中应加入______________，与实验组同时培养6 h后，若实验组液体培养基的混浊度比对照组________(填“高”或“低”)，则可明确疑似患者被炭疽杆菌感染；反之则排除。

答案

(1)显微镜

(2)高压蒸汽

有机碳

(3)细菌大量繁殖

等量生理盐水

低

解析

(1)炭疽杆菌是原核单细胞生物，观察它的结构应借助显微镜。(2)微生物培养基需采用高压蒸汽灭菌。实验所用培养基的碳源应为有机碳，因为炭疽杆菌为异养型微生物。(3)35 ℃培养24 h，细菌大量繁殖会

导致液体培养基变混浊，对照组不能含有细菌，根据等量原则应加入等量的生理盐水，实验组加入噬菌体液后，由于噬菌体能够使炭疽杆菌死亡，故实验组液体培养基的混浊度比对照组低。

13.某些农作物秸秆富含纤维素，纤维素经过水解可以形成葡萄糖，葡萄糖再经过发酵可以生产酒精。如图是利用农作物秸秆生产酒精的大致流程，请回答下列问题：

(1)农作物秸秆含有丰富的纤维素，纤维素可以经过纤维素分解菌分解成葡萄糖。人们常常从土壤中分离纤维素分解菌。筛选纤维素分解菌常用的方法是__________________。其实验流程是：土壤取样→选择培养→________→将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上→挑选产生__________的菌落。

(2)纤维素分解菌能合成纤维素酶，纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少含有三种组分，即____________________________。前两种酶使纤维素分解成________________，第三种酶继续分解成葡萄糖。

(3)图中发酵阶段常用的菌种是酵母菌，在酒精发酵时一般将温度控制在________℃。发酵后是否有酒精产生，可以用________________来检验。

(4)利用葡萄能生产果酒，进而生产果醋，生产果醋常用的菌种是醋酸杆菌，醋酸杆菌与酵母菌在代谢类型上的区别是_______________________________________________________。

答案

(1)刚果红染色法

梯度稀释

透明圈

(2)C1酶、CX酶、葡萄糖苷酶

纤维二糖

(3)18～25

酸性重铬酸钾

(4)醋酸(杆)菌是好氧型，酵母菌是兼性厌氧型

解析

(3)果酒发酵一般将温度控制在18～25 ℃，酒精可用酸性条件下的重铬酸钾来检测。(4)醋酸菌是需氧型，酵母菌是兼性厌氧型。