课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数优秀说课稿

课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

一、教学目标：

1、利用选择培养基分离细菌

2、运用相关技术解决生产生活中有关微生物计数的问题

二、重点难点：

1、重点：对土壤的选取和选择培养基的配制

2、难点：对分解尿素的细菌的计数

三、课时安排：1课时

四、教学过程：

（一）课题背景：

1、课题题目的分解：土壤中（分解尿素的）细菌的分离与计数

2、明确学习目标：

①能够利用选择培养基分离出土壤中分解尿素的细菌。②对该种细菌进行计数。

3、尿素（碳酰胺）是一种重要的农业氮肥，但并不能直接被农作物吸收，只有当土壤中的细菌将尿素分解成氨，才能更好地被作物吸收利用，这些细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成脲酶，

（二）研究思路：

我们如何从土壤中分离出能够分解尿素的细菌呢？先来看一个实例。

（1）原因：70-80℃的高温条件淘汰了绝大多数的微生物，耐热Taq可以存活。

（2）启示：生物在适应环境，而环境对生物也有一定的选择作用，寻找目的菌种，要根据它对生存环境的要求，到相应环境中去寻找。

（3）实验室微生物筛选原理：人为提供有利于目的菌株生长的环境条件，同时抑制或阻止其他微生物的生长。

本节课的学习目标是：从土壤中分离能够分解尿素的微生物，我们如何根据微生物的特点，配制培养基呢？

请同学们思考并回答：以尿素作为唯一氮源。

分析课本22页栏旁的培养基配方：在该培养基配方中，为微生物的生长提供碳源的是

葡萄糖

，提供氮源的的是

尿素

，琼脂的作用是

凝固剂

。

该培养基选择分解尿素的微生物的原理：只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素，以尿素作为氮源，不能合成脲酶的微生物由于不能分解尿素，缺乏氮源而不能生长繁殖，受到抑制，所以用此培养基就能够选择出分解尿素的微生物。

（4）总结选择培养基的概念：

微生物学中，将允许特定种类微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基称作选择培养基。

举例说明：缺乏氮源的选择培养基可用来分离固氮微生物；缺乏碳源的选择培养基可用来分离自养微生物；加入青霉素的选择培养基可用来分离酵母菌、霉菌等真菌；加入高浓度食盐水的选择培养基可以用来分离金黄色葡萄球菌。

（三）统计菌落数目

常用的统计方法有：显微镜直接计数法、滤膜法、稀释涂布平板法

（1）显微镜直接计数法：

原理：利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量。

过程：

公式：每毫升原液中含菌数=（每小格平均菌数×400）÷计数室容积×稀释倍数

（2）滤膜法：

P26将已知体积水过滤后，将滤膜放在伊红美蓝培养基上培养，在该培养基上大肠杆菌菌落呈黑色，可以根据培养基上黑色菌落的数目，计算出大肠杆菌的数量。

（3）稀释涂布平板法：

原理：当样品稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约有多少活菌。

计算公式：每克样品中菌株数=（C÷V）×

M C—某一稀释度下平板上生长的平均菌落数

V—涂布平板时所用的稀释液的体积

M—稀释倍数

注意事项：一般选择菌落数在30—300的平板进行计数

【Q】：利用稀释涂布平板法成功统计菌落数目的关键是什么？

分析教材实例：

第一位同学只涂布了一个平板，无重复组

第二位同学设置了重复，但结果不同平板上菌落数相差较大，说明操作过程可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板计数值来求平均值。

为使结果接近真实值，可将同一稀释度样品涂布到三个或三个以上的平板上，经培养计算出菌落平均数。统计的菌落数往往比活菌数目低，当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落，因此统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。

（四）设置对照

（1）目的：排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验可信度

（2）常见对照：

空白对照：不给对照组任何处理

条件对照：给对照组施以处理，但不是所要研究的处理因素，仅作为对照

自身对照:对照和实验组都在同一研究对象上

相互对照：几个实验组相互对照

（3）分析教材中实例：

方案1：其他同学用A同学的土样进行实验。

方案2：A同学以不接种的培养基作为空白对照。

（五）实验设计：

1、器材：灭菌小铁铲，用于培养土壤中分解尿素的微生物的培养基，无菌吸管，无菌水，试管（盛有9ml无菌水），试管架和无菌培养皿，记号笔，无菌信封，酒精灯，烧瓶，涂布器。

2、实验流程：

3、注意事项：

土壤微生物主要分布在距地表3～8cm的近中性土壤中，约70％～80％为细菌。

分离不同的微生物采用不同的稀释度，其原因是不同微生物在土壤中含量不同，其目的是保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板。细菌稀释度为104、105、106，

放线菌稀释度为103、104、105，真菌稀释度为102、103、104。

培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌一般在30～37℃培养1～2d，放线菌一般在25～28℃培养5～7d，霉菌一般在25～28℃的温度下培养3～4d。

在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。

取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。

1）应在火焰旁称取土壤 10 g。将称好的土样倒入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，塞好棉塞。

2）在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行。

3）实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。

4)为了提高效率，在操作时更加有条不紊，应当事先规划时间。

5）在研究未知微生物时务必规范操作，以防被致病微生物感染，实验后一定要洗手。

4、结果分析与评价：

对分离的菌种作进一步的鉴定，还需要借助生物化学的方法。

在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨。氨会使培养基的碱性增强，PH升高。因此，我们可以通过检测培养基pH变化来判断该化学反应是否发生。

在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后，如果PH升高，指示剂将变红，说明该细菌能够分解尿素。

5、课后小结：

土壤

中尿素分解菌的分离与计数

分离筛选微生物的原理

人为

条件

有利于目的菌株生长

抑制或阻止其他微生物生长

稀释涂布平板法

显微镜直接计数

微生物计数方法与原理

对照设置与重复设置

实验设计

实验方案

实验操作

结果与分析