课题3　血红蛋白的提取和分离教学内容

选修1课时14 血红蛋白的提取和分离

班级:__________姓名:__________设计人__________日期__________ 课前预习

· 预习案

学习目标

1

1．了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。

2．体验提取生物大分子的基本过程和方法。

自主梳理

1

1．蛋白质的分离原理：

根据蛋白质各种特性的差异分离不同种类的蛋白质，如分子的________、所带电荷的________、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等。

2．凝胶色谱法：

(1)概念：也称做________，是根据________分离蛋白质的有效方法。

(2)

(3)分离原理：

分离物质[来源:学科网ZXXK] 相对分子质量较大

相对分子质量较小

3．缓冲溶液：

(1)组成：通常由1〜2种________溶解于水中配制而成。

(2)作用：抵制外界的酸和碱对________的影响而保持其稳定。

4．电泳：

(1)概念：指________在电场的作用下发生________的过程。

通道

路程

速度

凝胶外部

________ ______ 较快

较长

_____

(2)原理：电泳利用了待分离样品中各种分子________以及分子本身的________的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。

(3)两种常用方法：________和聚丙烯酰胺凝胶电泳。

5．血红蛋白的提取和分离：

(3)________(即样品的加入和洗脱)：________。

(4)纯度鉴定：________________。

6．凝胶色谱操作：

(1)凝胶色谱柱的制作。

①取长40 cm，内径为1.6 cm的玻璃管，________。

②选择适合封堵玻璃管口的________，中间打孔，孔径大小要能够紧密插入0. 5 mL的移液管。

③将橡皮塞上部用刀切出锅底状的凹穴，将0. 5 mL的________头部切下5 cm长的一段，插入橡皮塞孔内，插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底

面。

④将尼龙网覆盖在橡皮塞的凹穴上，再用________将橡皮塞上部包好，插到玻璃管的一端。

⑤在色谱柱下端用________头部作出口部位，连接一细的尼龙管；并用螺旋夹控制尼龙管的打开与关闭，

尼龙管的另一端放入收集器内。

⑥柱顶部的制作，在色谱柱的另一端插入安装了玻璃管的________。

(2)凝胶色谱柱的装填。

①材料：本实验使用的是________。

②方法：凝胶用________充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，一次性缓慢倒入色谱柱内。

③注意事项。

a.商品凝胶使用前需直接________________；

b.装填时可________，使凝胶装填均匀；

c.不能有气泡存在，防止其________________________________，降低分离效果；

d.不能发生________________的现象。

④检验：如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功。

(3)样品的加入与洗脱。

调整缓冲液面：与凝胶面平齐

↓

滴加透析样品：用吸管将(1)mL透析后的样品加到色谱柱的________ ↓

样品渗入凝胶床：打开下端出口

，使________ ↓

洗脱：打开下端出口

，用________洗脱

↓

收集：待________接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集

预习小测

1

1．判断正误：凝胶色谱法分离蛋白质时利用了蛋白质相对分子质量大小和形状的不同。

2．判断正误：在凝胶色谱法分离过程中，血红蛋白比相对分子质量较小的杂蛋白移动慢。

3．判断正误：电泳时带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。

4．判断正误：

猪成熟红细胞中缺少细胞器和细胞核，提纯时杂蛋白较少。

5．判断正误：用于透析的薄膜具有选择透过性。

6．判断正误：可通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去。

7．判断正误：若红色区带不均匀地移动，说明色谱柱制作成功。

♒♒♒♒♒♒♒知识拓展

· 探究案♒♒♒♒♒♒♒

探究1凝胶色谱法与电泳法

1

1．凝胶色谱法的概念：

凝胶色谱法也称作分配色谱法，是根据_________的大小分离_________的有效方法。

2．凝胶色谱法的凝胶色谱法的原理：

大多数凝胶是一些微小的_________球体，内部有许多贯穿的通道，当相对分子质量_________的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量_________的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程_________，移动速度_________；而相对分子质量_________的蛋白质无法进人凝胶内部的通道，只能在_________移动，路程_________，移动速度_________。相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。

3．缓冲溶液的作用：

在一定范围内，缓冲溶液能抵制外界的酸和碱对溶液_________的影响，维持pH基本不变。

4．缓冲溶液的配制

通常由1〜2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的_________就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。

5．电泳的概念：指_________在_________的作用下发生_________的过程。

6．电泳的原理：

许

多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有_________的基团，在一定的PH下，这些基团会带上_________或_________。在电场的作用下，这些带电子分子会向着与其所带电荷_________的电极移动。电泳利用了待分离样'品中各种分子_________的差异以及分子本身的___ ______、_________不同，使带电分子产生不同的_ ________，从而实现样品中各种

分子的分离。

7．常用的电泳方法：__________________和___________________。

8．凝胶色谱法(见下表) 白质的分离原理

根据需要被分离的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离

白质分子运动情况

类型[来源:学*科*网Z*X*X*K] 相对分子质量大[来源:学科网][来源:学+科+网Z+X+X+K] 相对分子质量小

大小

方向

速度

路径

直径较大

直径较小

无规则扩散

垂直向下运动

较快

较短

较慢

较长

洗脱次序

先流出

后流出

9．电泳法(见下表) 原理

电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，

从而实现样品中各种分子的分离

常用方法

琼脂糖凝胶电泳

由于琼脂糖本身不带电荷，所以，各种分子在电场中的迁移速率因各种分子的带电性质差异、分子大小和形状不同而不同，从而得以分离

聚丙烯酰胺凝胶电泳

蛋白质在SDS—聚丙烯酰胺凝胶中所带的电荷被掩盖，使电泳

迁移率完全取决于分子的大小

典例精析

1

下列关于电泳的叙述中，正确的是

A.电泳是指不带电的分子在电场的作用下发生迁移的过程

B.电泳的过程要在一定的pH下，所以一定要使用缓冲液

C.交联葡聚糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳是两种常用的电泳方法

D.聚丙烯酰胺凝胶电泳中，溶液中加人十二烷基硫酸钠(SDS)，电泳的迁移率主要取决于分子所带电荷的多少和相对分子质量的大小

变式训练

1

凝胶色谱法是分离蛋白质分子的一种常用方法，但并非所有的蛋白质都可以用此方法进行分离，能分离的蛋白质分子之间必须

A.具有相同的相对分子质量

B.相对分子质量不同，但都是相对分子质量较大的分子

C.相对分子质量不同，但都是相对分子质量较小的分子

D.具有不同的相对分子质量

探究2血红蛋白的提取和分离实验操作

1

10．蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。

(1)样品处理

①红细胞的洗涤：采集血样，低速短时间__________，吸出__________后加生理盐水洗涤，再低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色。目的是除去杂质，

以利于后续步骤的分离纯化。

②血红蛋白的释放:将洗涤好的红细胞依次加入__________至原血液体积、40%体积的__________，置于磁力搅拌器上搅拌10 min，使红细胞吸水________，血红蛋白释放出来。

③分离血红蛋白溶液：将搅拌好的混合液转移到________中，以2 000 r/min的速度________ 10 min。使血红蛋白和其他杂质分离开，便于下一步对血红蛋白的纯化。

④透析：取1 mL的血红蛋白溶液装人透析袋中，将透析袋放入盛有300 mL的物质的量浓

度为20 mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12 h(以除去样品中相对分子质量较小的杂质)。

(2)凝胶色谱操作

①凝胶色谱柱的制作：准备材料→加工________→安装________。

②凝胶色谱柱的装填。

③样品的加入和洗脱。

11．蛋白质的提取和分离：

样品处理

(1)红细胞的洗涤

①过程：a.采集血样→b.低速短时间离心→c.吸出血浆→ d.盐水洗涤→e.低速离心→f.重复d、e三次。

②目的：除去杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化。

③注意事项：离心时转速要低，离心时间要短，一般为500 r/min，离心2 min，否则白细胞一同沉淀，达不到分离效果。洗涤三次后如上清液仍有黄色，可增加洗涤次数，

否则血浆蛋白无法除净。

(2)血红蛋白的释放

①过程(见下图)：

②目的：使红细胞涨破，血红蛋白释放出来。

③结果：在蒸馏水和甲苯的作用下，细胞破裂，释放出血红蛋白。

(3)分离血红蛋白溶液

①过程:将搅拌好的混合液转移到离心管中，以2 000 r/min 的速度离心10 min。

②目的:经过离心使血红蛋白和其他杂质分离开来，便于下一步对血红蛋白的纯化。

③结果：

溶液分为4层

第1层(最上层)：甲苯层(无色透明) 第2层(中上层)：脂溶性物质沉淀层(白色薄层固体) 第3层(中下层)：血红蛋白的水溶液层(红色透明液体)第4层(最下层)：杂质沉淀层(暗红色) 将试管中液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层；于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。

12．蛋白质的粗分离——透析

(1)原理

透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。

(2)过程

取1 mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300 mL的物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12 h。

(3)目的

①除去样品中相对分子质量较小的杂质。

②用于更换样品的缓冲液。

13．蛋白质的纯化——凝胶色谱操作

(1)凝胶色谱柱的制作

①取长40cm，内径为1.6cm的玻璃管，两端需用砂纸磨平。

②柱底部制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱将橡皮塞上部包好。

③柱顶部制作：打孔→安装玻璃管。

④组装:将上述三部分按相应位置组装成一个整体。

(2)凝胶色谱柱装填

计算：根据色谱柱的内体积计算所需凝胶量

↓

凝胶溶胀：凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液

↓

固定:将色谱柱垂直固定在支架上

↓

装填：将凝胶悬浮液一次性装填入色谱柱内

↓

洗涤平衡:用20 mmol/L的磷酸缓冲液(pH为7. 0)洗涤平衡凝胶12 h，使凝胶装填紧密

(3)样品的加人和洗脱

①调整缓冲液面：打开色谱柱下端流出口，调整缓冲液与

↓凝胶面平齐

②滴加透析样品:关闭下端出口，用吸管小心将1 mL样品

↓

加到色谱柱顶端

③样品渗人凝胶床:加样后打开下端出口，使样品完全进

I 入凝胶层

④再调整缓冲液面：关闭出口，小心加入20 mmol/L的磷

↓酸缓冲液到适当高度

⑤洗脱:打开下端出口，用磷酸缓冲液洗脱

↓

⑥收集:待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5 mL ー试管连续收集

14．蛋白质的纯度鉴定——SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳

判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。鉴定的方法中，使用最多的是SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。

典例精析

1

凝胶色谱柱长为40 cm,内径为1. 6 cm，下列有关叙述中，不正确的是

A.凝胶色谱柱直径的大小不影响分离的效果，但直径过大造成洗脱液体积增大，样品的稀释度过大

B.凝胶色谱柱过高超过1 m，不影响分离的效果，但耗用洗脱液过多，样品的稀释度过大

C.凝胶色谱柱过矮，则影响混合物的分离度

D.以上说法有两项正确

变式训练

1

下列关于样品的加入和洗脱的操作

中，不正确的是

A.加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面

B.加样后，打开下端出口

，使样品渗入凝胶床内

C.等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口

D.用吸管小心地将1 mL透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面

随堂自测

1

1．凝胶色谱法分离蛋白质的原理依据是

A.根据蛋白质分子与凝胶的亲和力的大小

B.根据蛋白质相对分子质量的大小

C.根据蛋白所带电荷的多少

D.根据蛋白质溶解度的大小

2．利用凝胶色谱法，什么样的蛋白质先洗脱出来

A.相对分子质量大的

B.溶解度髙的

C.相对分子质量小的

D.所带电荷多的

3．关于电泳的说法不正确的是

A.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程

B.带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动

C.蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少

D.用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电泳迁移率完全取决于分子的大小

4．样品的加入和洗脱的操作不正确的是

A.加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面

B.加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内

C.等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口

D. 用吸管小心地将1 mL透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面

5．在利用凝胶电泳法分离蛋白质时，一定要加入缓冲溶液，起到的作用是

A.使酶的活性最高

B.使蛋白质的活性最高

C.维持蛋白质所带电荷

D.使蛋白质带上电荷

6．下面是凝胶色谱法分离血红蛋白时样品加入(图I)和洗脱(图Ⅱ)示意图。请据图回答下列问题：

(1)在加样品示意图中，正确的顺序是________。

(2)用吸管加样品时，应注意正确操作，分别是：

①________________________________________________; ②________________________________________________；

③________________________________________________。

(3)等样品_____________________后，加入缓冲溶液。待________接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每________mL收集一管，连续收集。

探究归纳

1

特别提醒：血红蛋白提取和分离的实验结果分析与评价(见下表) 项目

分析

血液样品的处理

①分层明显→样品处理完成

②分层不明显的原因洗涤次数少，未能除去血浆蛋白离心速度过高或时间过长

凝胶色谱柱的装填

①放一支与凝胶柱垂直的日光灯→直接检查凝胶是否装填得均匀

②加入大分子有色物质如蓝色葡聚糖一2 000或红色葡聚糖，若色带均匀、狭窄、平整→装填成功

血红蛋白的分离

①血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随洗脱液缓慢流出→分离成功

②血红蛋白的红色区带歪曲、散乱、变宽→分离效果不好，可能与凝胶色谱柱的装填有关

选修1课时14 血红蛋白的提取和分离

详细答案

课前预习

· 预习案

【自主梳理】

1．形状和大小

性质和多少

2．(1)分配色谱法

相对分子质量的大小

(2)多孔球体

多糖类化合物贯穿的通道

(3)较短

凝胶内部较慢

3．(1)缓冲剂

(2)溶液pH 4．(1)带电粒子

迁移

(2)带电性质的差异

大小、形状

(3)琼脂糖凝胶电泳

5．(1)去除杂蛋白

低速短时间离心

蒸馏水和甲苯

过滤除去脂溶性沉淀层

有机溶剂(甲苯)

血红蛋白溶液

(2)小分子

大分子

相对分子质量较小

20 mmol/L的磷酸缓冲液中

(3)纯化

凝胶色谱法

(4)SDS——聚丙烯酰胺凝胶电泳

6．(1)①两端磨平

②橡皮塞

③移液管

④尼龙纱

⑤移液管

⑥橡皮塞

(2)①交联葡聚糖凝胶

②蒸馏水

③放在洗脱液中膨胀

轻轻敲动色谱柱

搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序

洗脱液流干，露出凝胶颗粒

(3)顶端

样品渗人凝胶床内磷酸缓冲液

红色的蛋白质

【预习小测】

1．×

2．×

3．√

4．√

5．×

6．√

7．×

♒♒♒♒♒♒♒知识拓展

· 探究案♒♒♒♒♒♒♒

【探究1 凝胶色谱法与电泳法】

1．相对分子质量

蛋白质

2．多孔

不同

较小较长

较慢

较大

凝胶外部

较短

较快

3．pH 4．使用比例

5．带电粒子

电场

迁移

6．可解离正电

负电

相反

带电性质

大小

形状

迁移速度

7．琼脂糖凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳

【典例精析】

B 【解析】电泳的过程实质上是带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程，A项错；最常用的电泳方法是琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳，C项错；聚丙烯酰胺凝胶电泳的过程中，为了清除电荷对迁移率的影响，可在凝胶中加入十二烷基硫酸钠(SDS)，SDS可以与各种蛋白质形成蛋白质一SDS复合物，SDS所带负电荷量远超过蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质之间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小，D项错；电泳过程是在一定的pH条件下进行的，所以要在溶液中加入缓冲液，以维持溶液pH的稳定。

【备注】SDS电泳成功的关键之一是电泳过程中，特别是样品制备过程中蛋白质与SDS的结合程度。由于制备凝胶的丙烯酰胺和N，N—亚甲基双丙烯酰胺具有很强的神经毒性，并

且容易被皮肤吸收，因此操作必须在通风橱内或通风处进行。TEMED和过硫酸胺对黏膜和上呼吸道、眼睛、皮肤等有很大的破坏作用，吞服可致命。因此在进行电泳操作时一定按照实验要求和步骤，在老师的指导下完成。操作时要戴好一次性手套。

【变式训练】

C 【解析】若在每种凝胶分离范围之外的分子，在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。对于分子大小不同，但同属于凝胶分离范围内的各种分子，在凝胶床中的分布情况是不同的，分子较大的只能进入孔径较大的那一部分凝胶。

【探究2血红蛋白的提取和分离实验操作】

10．(1)①离心

血浆

②蒸馏水

甲苯

涨破

③离心管离心

(2)①橡皮塞

色谱柱

【典例精析】

B 【解析】凝胶色谱柱直径大小不影响分离的效果，但是直径过大会造成洗脱液体积增大，样品的稀释度过大，因此应选择直径不超过2 cm的色谱柱。凝胶色谱柱的高度与分离度有关，一般不超过1 m,过

短也会影响混合物的分离。

【变式训练】

A 【解析】加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。

【备注】无

【随堂自测】

1．B 2．A 3．C 4．A 5．C 6．(1)④→①→②→③

(2)①不要破坏凝胶表面

②贴着管壁加样

③使吸管管口沿着管壁环绕移动

(3)完全进入凝胶层

红色的蛋白质

5 【解析】在装填好的色谱柱中加入样品时，先打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓缓下降到与凝胶面平齐，关闭出口。用吸管小心地将lmL透析后的样品加到色谱柱的顶端，注意加入时要使吸管管口沿管壁环绕移动，贴着管壁加样，以免破坏凝胶面(④)，加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全渗入之后，关闭下端出口(①)，接着采用同样的方法加入緩冲液到适当髙度(②)，连接緩冲溶液洗脱瓶进行洗脱(④)。待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5mL收集一管，连续收集。