课题3　分解纤维素的微生物的分离教学评价实录

分解纤维素的微生物的分离

一、教学目标

1.知识与技能

a、简述纤维素酶的种类及作用。

b、掌握从土壤中分离某种特定微生物的操作技术。

2.过程与方法

a、分析分离分解纤维素的微生物的实验流程。

b、掌握实验操作的原理。

3.情感、态度与价值观

a、通过自主设计、完成实验,培养勇于探究的科学精神。

b、通过了解土壤中能分解纤维素的微生物在保护环境中的作用,增强社会责任感。

二、学情分析

本课题作为课题1的应用和课题2的深入,分离某种特定的微生物,难度较大、探索性更强,在高考中考查的可能性也很大。教材在课题背景中利用学生已经学过的纤维素的化学组成推广到生活中纤维素的广泛分布和应用。而若要充分利用纤维素,就应将其分解,引导学生自然而然地过渡到分解纤维素的微生物及其产生的相关酶。之后,教材紧接介绍了纤维素、纤维素酶以及如何从土壤中分离分解纤维素的微生物,通过对课题中实验设计思路的深入学习,要求学生掌握从土壤中分离某种特定微生物的操作技术。

三、重点难点

教学重点: 从土壤中分离分解纤维素的微生物。

教学难点: 从土壤中分离分解纤维素的微生物的具体过程步骤稀释和涂布。

四、教学过程

4.1第一学时

4.1.1教学活动

活动1【导入】情境设置

纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质,大量存在于植物的根茎叶等器官中。地球上40%-60%的纤维素能被土壤中某些微生物分解利用,这是因为它们能够产生纤维素酶。人们要想利用秸秆等废弃物生产酒精,用纤维素酶处理服装面料等,就需要对这些微生物进行研究与应用,而要研究这些微生物,首先要将它们从土壤中种类众多的微生物中分离出来。本课题中,我们就将探讨如何分离土壤中能够分解纤维素的微生物。

活动2【讲授】基础知识和实验操作基本步骤

【基础知识】

(一)纤维素和纤维素酶

1、棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物。

2、纤维素酶的组成及作用:纤维素酶是一种复合酶,一般认为它至少包括三种组分,即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶,前两种酶使纤维素分解成纤维二糖,第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。

(二)纤维素分解菌的筛选

1、方法:刚果红染色法

2、纤维素分解菌筛选方法的原理:刚果红是一种染料,它可以与纤维素形成红色复合物,但并不和纤维二糖、葡萄糖发生这种反应。当纤维素被纤维素酶分解后刚果红—纤维素的复合物就无法形成,培养基中会出现以纤维素分解为中心的透明圈。这样我们可以通过是否产

生透明圈来筛选纤维素分解菌。

【实验设计】

(一)分离分解纤维素的微生物的实验流程

土壤取样→选择培养→梯度稀释→将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落

1、土壤取样

选择纤维素丰富的环境,依赖于生物与环境的互相依存关系,在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高,因此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环境。

2、选择培养

(1)目的:增加纤维素分解菌的浓度,以确保能够从样品中分离到所需要的微生物

(2)操作:将土样加入装有30ml选择培养基的锥形瓶中,将锥形瓶固定在摇床上,在一定温度下震荡培养1~2天,直至培养液变浑浊。也可重复选择培养。

3、梯度稀释

按照课题1的稀释操作方法,将选择培养后的培养液进行等比稀释101~107倍,之后,将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上。

4、将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上

(1)制备培养基:参照旁栏中的比例。

(2)倒平板操作。

(3)涂布平板:将稀释度为104~106的菌悬液各取0.1ml涂布在培养基上,30℃倒置培养,菌落周围会出现明显的透明圈。

5、挑选产生透明圈的菌落

参照课本刚果红染色法,挑选产生透明圈的菌落,一般即为分解纤维素的菌落。

(二)刚果红染色法

方法一:先培养微生物,再加入刚果红进行颜色反应

方法二:在倒平板时就加入刚果红

方法一

缺点是操作烦琐,加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂; 优点是这样显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用。

方法二

优点是操作简便,不存在菌落混杂问题; 缺点一是由于培养基中还含有淀粉类物质,可以使能产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应;缺点二有些微生物具有降解色素的能力,它们在长时间培养过程中会降解刚果红,形成明显的透明圈,与纤维

素分解菌不易区分。

(三)土壤中纤维素分解菌的分离实验的具体操作步骤

1、土样采集

土样采集的方法与本专题课题2类似。

土样的采集要选择富含纤维素的环境,这是因为在纤维素含量丰富的环境,通常会聚集较多的分解纤维素的微生物。如果找不到合适的环境,可以将滤纸埋在土壤中,过一个月左右也会有能分解纤维素的微生物生长。

2、选择培养

选择培养需要的仪器有:250 mL锥形瓶、无菌称量瓶、药匙、1 mL和10 mL的移液管、天平、摇床、温度计等。

培养基的制备参照课本旁栏中的比例配制。在250 mL锥形瓶中装入30 mL培养基,用8层纱布做成瓶塞,将瓶口塞紧,再在瓶塞外包裹两层包装纸(或报纸),用线绳扎紧,在121℃下高压蒸汽灭菌20 min。

选择培养的操作:称取土样20g,在无菌条件下加入装有30mL培养基的摇瓶中。将摇瓶置于摇床上,在30℃下振荡培养1~2 d,至培养基变混浊。此时可以吸取0.1 mL培养液进行梯度稀释和涂布平板,也可以按课本中所述,重复选择培养的步骤一次,然后再进行梯度稀释和涂布平板。

3、刚果红染色法分离纤维素分解菌

这一步所需要的仪器有:无菌培养皿、涂布器、1 mL移液管,装

有9mL无菌水的20 mL大试管,温箱等。

培养基的制备参照课本旁栏中的比例配制。在500mL三角瓶中装入200mL培养基,在121℃下高压蒸汽灭菌20 min。

倒平板操作:将灭菌后的固体培养基熔化,按无菌操作的要求,在无菌的培养皿中倒入15~20 mL培养基,凝固后待用。

制备菌悬液:按照本专题课题1的稀释操作方法,将选择培养后的培养基进行等比稀释,稀释最大倍数至106。

涂布平板:将稀释度为104~106的菌悬液各取0.1 mL,滴加在平板培养基上,用涂布器将菌液涂布均匀,在30℃倒置培养,至菌落长出。每个稀释度下需涂布3个平板,并注意设置对照。刚果红染色的具体操作步骤参照课本[资料三]。

(四)课题成果评价

1、培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落:对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。如果观察到产生透明圈的菌落,则说明可能获得了分解纤维素的微生物。

2、分离的结果是否一致:由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量,因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同,学生也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。

【课堂小结】

纤维素酶是一种复合酶,一般认为它至少包括三种组分,即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶,前两种酶使纤维素分解成纤维二糖,第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。

纤维素分解菌的筛选方法是刚果红染色法,它有两种方法,一是先培养微生物,再加入刚果红进行颜色反应;二是在倒平板时就加入刚果红

。

活动3【活动】学生活动

活动1:阅读“纤维素与纤维素酶”,回答下列问题: 棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物。纤维素的分解需要在纤维素酶的催化作用下完成,请完成下列过程: 〖思考1〗实验分析:投影的小实验是如何构成对照的? 在一支试管中添加纤维素酶,另一支试管不添加纤维素酶;尽管醋酸-醋酸钠缓冲液用量不同,但都能维持相同的pH。

〖思考2〗1个酶活力单位是指在温度为25℃,其它反应条件最适宜情况下,在1 min内转化1mmol的底物所需要的酶量。

活动2:阅读“纤维素分解菌的筛选”,回答下列问题: 筛选纤维素分解菌的方法是刚果红染色法。该方法可以通过颜色反应直接筛选。其原理是:刚果红可以与纤维素形成红色复合物,当纤维素被纤维素酶分解后,红色复合物无法形成,出现以纤维素分解菌为中心的透明圈,我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

(三)实验设计

活动3:完成实验方案流程图,讨论回答问题

〖思考3〗实验流程中“选择培养”的培养基类型是什么?该培

养的目的是什么? 液体选择培养基。其目的是使纤维素分解菌增殖,含量增多。

〖思考4〗本实验流程与尿素分解菌的分离实验流程有哪些异同? 尿素分解菌的分离实验流程是将土样制成的菌悬液直接涂布在选择培养基上;本课题通过选择培养使细菌增殖后,再涂布在鉴别培养基上。其它操作基本基本共同。

活动4:阅读投影资料一土壤取样”,回答下列问题: 1、纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中。

2、为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌? 生物适应一定环境,环境对生物具有选择作用,只有在纤维素含量丰富的环境中纤维素分解菌的含量才会高于其它普通环境,从而提高获得目的微生物的几率。

3、将滤纸埋在土壤中有什么作用?你认为滤纸应该埋进土壤多深? 人工设置适宜环境,使纤维素分解菌相对聚集。将纸埋于深约250px的腐殖土壤中。

活动5:阅读投影资料二“选择培养基”,回答以下三个问题: 4、纤维素分解菌选择培养基属于液体培养基,原因是没有添加琼脂成分。

5、培养基选择作用机制是以纤维素粉为唯一碳源,只有纤维素分解菌才能生存。

6、若设置一个对照实验说明选择培养的作用,应控制的变量是将

纤维素粉改为葡萄糖。

活动5:阅读投影资料三“刚果红染色法”填表比较两种染色法的各自的优缺点: 〖思考5〗为什么选择培养能够”浓缩”所需的微生物? 在选择培养条件下,可使能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖,而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制,因此可以起到

“浓缩”的作用。

(四)、结果分析与评价

活动6:阅读“课题延伸”,回答: 1、为了确定分离得到的是纤维素分解菌,还需要进行发酵产纤维素酶实验,纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵。

2、纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的葡萄糖含量进行定量测定。

活动4【练习】跟踪练习

1.纤维素酶可以将下列哪种物质分解( ) A.牛肉片 B.鱼片 C.滤纸条 D.塑料条

2.下列不属于纤维素酶组分的是( ) A.C1酶 B.Cx酶 C.葡萄糖苷酶 D.半乳糖苷酶

3.刚果红能与下列哪种物质形成红色复合物( ) A.葡萄糖 B.纤维二糖 C.麦芽糖 D.纤维素

4.分离纤维素分解菌的实验过程中操作有误的是( )

A.经选择培养后将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上

B.富集培养这一步可省略,但培养纤维素分解菌少

C.经稀释培养后,用刚果红染色

D.对照组可用同样量的培养液涂布到不含纤维素的培养基上

5.下列有关分解纤维素微生物的分离的叙述,不正确的是( ) A.纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵

B.对分解纤维素的微生物进行了初步筛选后,无需再进行其他实验

C.纤维素酶的测定方法,一般是对所产生的葡萄糖进行定量的测定

D.纤维素酶是一种复合酶

6.在对纤维素分解菌进行选择培养时用液体培养基的目的是( ) A.用液体培养基可获得大量菌体

B.纤维素分解菌适宜在液体培养基上生长

C.用液体培养基可以充分利用培养基中营养物质

D.用液体培养基可获得高纯度的纤维素分解菌

7.在将样品稀释涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基之前一般先进行选择培养,其主要目的是( ) A.完全除去其他微生物 B.没有意义,去掉这一步更好

C.增加纤维素分解菌的浓度 D.使纤维素分解菌充分长大

8.两种刚果红染色法的结果是( ) A.均会出现透明圈 B.均不会出现透明圈

C.方法一出现,方法二不出现 D.方法一不出现,方法二出现

9.富集培养是微生物学中最强有力的技术手段之一。主要是指利用不同微生物的生命活动特点的不同,制定环境条件,使仅适应该条件的微生物旺盛生长,从而使其在群落中的数量大大增加,人们能够更容易地从自然界中分离到所需的特定微生物。

富集条件可根据所需分离的微生物的特点,从物理、化学、生物及综合多个方面进行选择,如温度、pH、紫外线、高压、光照、氧气、营养等许多方面。

下图描述了采用富集方法从土壤中分离能降解酚类化合物对羟基苯甲酸的微生物的实验过程。

(1)本实验所需培养基为_________,碳源为_________。

(2)实验原理是_________________________________________________________。

(3)①→③重复培养的目的是_____________________________________。

(4)⑤的菌落中大部分是降解_________的微生物。

(5)⑥为_________组,⑦为_________组,设置⑥的目的是_________。

(6)⑤→⑥采用_________法,接种到⑥的培养基中,在操作过程中为防止污染应注意的事项是__________________。