课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数第二课时 公开课

课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离和计数

华容一中 彭罗红

一、教材内容解读

要点1 筛选菌株w.w.w.k.s.5.u.c.o.m （1）实验室中微生物的筛选应用的原理

人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。

（2）选择性培养基

在微生物学中，将允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。

（3）配制选择培养基的依据

根据选择培养的菌种的生理代谢特点加入某种物质以达到选择的目的。例如，培养基中不加入有机物可以选择培养自养微生物；培养基中不加入氮元素，可以选择培养能固氮的微生物；加入高浓度的食盐可选择培养金黄色葡萄球菌等。

要点2 统计菌落数目

（1）测定微生物数量的常用方法有稀释涂布平板法和显微镜直接计数。

（2）稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目的原理

当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活细菌。为了保证结果准确，一般设置3～5个平板，选择菌落数在30～300的平板进行计数，并取平均值。统计的菌落数往往比活菌的实际数目低，因此，统计结果一般用菌落数而不是活菌数来表示。

要点3 设置对照

设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

要点4 实验设计

实验设计包括实验方案，所需仪器、材料、用具和药品，具体的实施步骤以及时间安排等的综合考虑和安排。

（1）土壤取样

从富含有机物、潮湿、pH≈7的土壤中取样。铲去表层土，在距地表约3～8cm的土壤层取样。

（2）制备培养基

准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基。牛肉膏蛋白胨培养基作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。

（3）微生物的培养与观察

将土样以1、101、102……依次等比稀释至107稀释度，按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管。注明培养基种类、培养日期以及平板培养样品的稀释度。将涂布好的培养皿放在30℃温度下培养。随着培养时间的延长，会有不同的菌产生。比较牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。

（4）细菌的计数

当菌落数目稳定时，进行计数，防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。求出平均值，根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。

要点5 实验案例

土壤中某样品细菌的分离与计数

实验的具体操作步骤如下。

1.土壤取样

从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。

2.制备培养基

准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为103～107。每个稀释度下需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基，因此共需要15个选择培养基，5个牛肉膏蛋白胨培养基。此外，还需要准备8个灭菌的试管和1个灭菌的移液管。

3.微生物的培养与观察

参考课本中图2-7的实验流程示意图，将10g土样加入盛有90mL无菌生理盐水的锥形瓶中（锥形瓶体积为250mL），充分摇匀，吸取上清液1mL，转移至盛有9mL的生理盐水的无菌大试管中，依次等比稀释至107稀释度，并按照由107～103稀释度的顺序分别吸取0.1mL进行平板涂布操作。按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管。

将涂布好的培养皿放在30℃温度下培养。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。

挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含酚红培养基的斜面中，观察能否产生如课本中图2-10的颜色反应。

4.细菌的计数

当菌落数目稳定时，选取菌落数在30～300的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。

要点6 疑难解答

（1）如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？

统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均值，然后按课本旁栏的公式进行计算

（2）为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？

这是因为土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。

二、教学目标

（一）知识与技能

利用选择培养基分离细菌，运用相关技术解决生产生活中有关微生物的计数

（二）过程与方法

分析研究思路的形成过程，找出共性和差异性

（三）情感、态度与价值观

形成无菌不在的概念，养成讲究卫生的习惯

三、

教学重点和难点 教学重点：

对土样的选取和选择培养基的配制

教学难点：

对分解尿素的细菌的计数

四、教学用具 多媒体

五、教学设计

第1课时

（一）引入新课

上节课我们学习了培养基的配置以及接种技术。下面我们来学习如何进行细菌的分离，获得所需要的目的微生物。

（二）探究新知

1．基础知识

1．1 尿素是一种重要的氮肥，农作物不能（能，不能）直接吸收利用，而是首先通过土壤中的细菌将尿素分解为

氨和CO2 ，这是因为细菌能合成

脲酶

。

1．2 科学家能从热泉中把耐热细菌筛选出来是因为

热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物

，这样也适用于实验室中微生物的筛选，原理是人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、PH等），同时抑制或阻止其他微生物生长

。

点评：生物适应一定环境，环境对生物具有选择作用。所以通过配制选择培养基、控制培养条件等选择目的微生物。

〖思考1〗在该培养基配方中，为微生物的生长提供碳源的是

葡萄糖

，提供氮源的的是

尿素

，琼脂的作用是凝固剂

。

〖思考2〗该培养基对微生物

具有

（具有，不具有）选择作用。如果具有，其选择机制是

只有能够以尿素作为氮源的微生物才能在该培养基上生长。

1．3在统计菌落数目时，常用来统计样品中活菌数目的方法是

稀释涂布平板法

。除此之外，

显微镜直接计数

也是测定微生物数量的常用方法。

【补充】显微镜直接计数是测定微生物的方法。

公式：观察到的红细胞平均数∶观察到的细菌平均数＝红细胞含量∶细菌含量

1．4 采用稀释涂布平板法统计菌落数目时，培养基表面生长的一个菌落，来源于

样品稀释液中一个活菌

。通过统计平板上的菌落数

，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在 30～300 的平板进行计数。

〖思考3〗从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数的计算方法是

（平均菌落数÷涂布的稀释液体积）×稀释倍数

。

〖思考4〗利用稀释涂布平板法成功统计菌落数目的关键是

恰当的稀释度

。

〖思考5〗第

二

位同学的结果接近真实值。你认为这两位同学的实验需要改进的操作是第一位同学需设置重复实验组；第二位同学统计的三个菌落数相差太大，说明操作有误，需重新实验。

1．5统计的菌落数比活菌的实际数目

低

。这是因为当两个或多个细胞在一起时，平板上观察到的只是

一个

菌落。因此，统计结果一般用菌落数

来表示。

1．6设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

1．7对照实验是指除了

被测试

的条件外，其他条件都

相同

的实验。满足该条件的称为

对照组，未满足该条件的称为实验

组。

〖思考6〗请设计本实验的对照实验组：

方案1：其他同学用A同学的土样进行实验。

方案2：A同学以不接种的培养基作为空白对照。

知识点一、微生物的分离与计数

1．筛选菌株

(1)自然界中目的菌株筛选的依据是

根据它对 的要求，到相应的环境中去寻找。

(2)实验室中微生物筛选的原理：人为提供有利于 生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时 或 其他微生物生长。

(3)选择培养基：

在微生物学中，将允许 种类的微生物生长，

同时 和 其他种类微生物生长的培养基，称作选择培养基。 2．统计菌落数目

(1)常用方法： 法。

(2)统计依据：当样品的 足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个 。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品大约含有多少活菌。

(3)平板选择菌落

计数时一般选菌落数在 的平板，计数公式为 。

3．设置对照

(1)对照实验：是指除了 以外，其他条件都相同的实验。

(2)主要目的：排除实验组中 对实验结果的影响，提高实验的可信度。例如为了确认培养基是否被杂菌污染，

需以 培养基培养作为空白对照。

[思维激活1] 上述的对照组培养基(牛肉膏蛋白胨培养基)是否也需接种？如何确认所制备的选择培养基的确起到了选择作用？

提示

为确认培养基是否被杂菌污染时，对照组的牛肉膏蛋白胨培养基不需接种。欲确认所制备的选择培养基是否起到了选择作用，应同时对对照组的牛肉膏蛋白胨培养基进行接种——若对照组培养基中菌落种类明显复杂于实验组，则可确认选择培养基的确起到了选择作用。

【巩固1】

苯酚是工业生产排放的有毒污染物质，自然界中存在着降解苯酚的微生物。某工厂产生的废水中含有苯酚，为了降解废水中的苯酚，研究人员从土壤中筛选获得了只能降解利用苯酚的细菌菌株，筛选的主要步骤如图所示，①为土壤样品。请回答下列问题

(1)②中培养目的菌株的选择培养基中应加入______作为碳源，②中不同浓度碳源的培养基______(A.影响；B.不影响)细菌的数量，如果要测定②中活细菌数量，常采用______法。

(2)④为对照，微生物在④中不生长，在⑤中生长，④与⑤培养基的主要区别在于____________________；使用____________法可以在⑥上获得单菌落。采用固体平板培养细菌时进行倒置培养的原因是______________________________ 解析

根据微生物对营养的需求，在培养基中加入或不加某些物质以达到促进目的菌生长，抑制或阻止其他杂菌生长的目的，然后再用涂布平板法、平板划线法或其他方法筛选出单个目的菌落，再接种培养即可获得纯目的菌。为防止培养基中水分蒸发形成的水珠落入培养基中影响菌体生长，所以要将培养皿倒置。在设计实验中要注意单一变量原则和对照原则，操作中要严格进行无菌操作。 答案

(1)苯酚

A 稀释涂布平板

(2)④的培养基没有加入苯酚作为碳源，⑤的培养基加入苯酚作为碳源

稀释涂布平板法或平板划线

以防止冷凝后形成的水珠滴落在培养基上污染培养基

(3)培养基灭菌，接种环境灭菌，接种过程无菌操作

本课题知识小结:

（三）、板书

课题2.2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

1．基础知识

2．实验设计

3．结果分析与评价