课题3　血红蛋白的提取和分离PPT配套教学设计内容

专题5课题3血红蛋白的提取和分离

【学习目标】

a.说出从血液中初步获取血红蛋白的原理和方法。

b.说明凝胶色谱法的原理和方法。

c.说出电泳的基本原理和方法。

【知识点梳理】

一、基础知识

蛋白质各种性质的差异，如

、

、

、

和

，等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。分离方法主要包

括

和

。

（一）．凝胶色谱法

1、概念：也称做

色谱法，是根据_____

_______的大小分离蛋白质的有效方法。

2、材料：

3、原理：凝胶实际上是一些微小的

，这些小球体大多数是由

构成的，如

或

。在小球体内部有许多贯穿的通道，当________

____不同的蛋白质通过凝胶时，_______

_________的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程________，移动速度较慢；而________

______的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程________，移动速度较快。_________

___不同的蛋白质因此得以分离。

4.过程（教材65页图5-13）

（二）缓冲溶液

(1)作用：在一定范围内，缓冲溶液能抵制外界的___

_____对溶液pH的影响，维持pH基本不变。

(2)配制：通常由1～2种________溶解于水中配制而成。调节________的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。

（3）意义：生物体内进行的各种生物化学反映都是在一定的PH下进行的，为了能够在实验室条件下准确模拟生物体内的过程，就必须

。因此，

和

，在生物化学的研究工作中有着极其重要的意义、

（三）电泳

(1)概念：是指_______粒子在电场的作用下发生_______的过程。

(2)原理：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的________下，这些基团会带上____________。在电场的作用下，这些________分子会向着

与其所带电荷________的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子_____

___的差异以及________的大小、________不同，使带电分子产生不同的______

__，从而实现样品中各种分子的分离。

(3)常用的电泳方法：琼脂糖凝胶电泳和______________电泳。

①琼脂糖凝胶电泳法：由于琼脂糖本身不带电荷，各种分子在电场中迁移速度决定于所带电荷性质的差异及分子的大小、形状的不同

。

②在测定蛋白质分子量时通常使用

。聚丙烯酰胺凝胶是由单体

和交联剂

在引发剂和

的作用下聚合交联成的具有

的凝胶。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速率取决于

它

等因素。为了

的影响，可以在凝胶中加入

。SDS能使

。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会

，因此测定的结果只是

单条

。SDS能与蛋白质形成

，SDS所带电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了

，使电泳迁移率完全取决于

。

二、实验操作

蛋白质的提取和分离一般分为四步：__

______、

、

和

。

（一）、样品处理和粗分离

血液是由

和各种

组成，其中

最多。在红细胞的组成中，除水分之外，约90%是

。血红蛋白由四条链组成，含

和两条

，其中每条肽链环绕一个

基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有

而呈现红色。

1、

红细胞的洗涤：

（1）目的：

。

（2）过程：采集的血样要及时分离红细胞，分离时采用_________

___离心，然后用胶头吸管吸出

，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加

入

，

10min，再低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至

，表明红细胞已洗涤干净。

（3）为防止血液凝固，应先加入

。

2、血红蛋白的释放：将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加蒸馏水到

，，再加__

____，置于____________上搅拌10 min，在

，红细胞破裂，释放出

。

3、分离血红蛋白溶液：将搅拌好的混合液转移到

中，以2 000 r/min的速度离心10 min后，可以明显看到试管中的溶液分为

层。第一层为无色透明的________，第2

层为

固体，是___________的沉淀层，第3层是红色透明液体，这是________的水溶液，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去____________层，于

中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。

4、透析：取1

mL的血红蛋白溶液装入________中，将________放入盛有300 mL的物质的量浓度为__________mmol/L的磷酸缓冲液中(pH为7.0)，透析12 h。

透析袋一般是用

制成的。透析袋能使

，而

保留在袋内。透析可以

。

（二）纯化——凝胶色谱操作

1、凝胶色谱柱的制作：

打孔→挖穴→安管→覆网→纱包→插管

。

2、凝胶色谱柱的装填。

装柱前要将色谱柱

在支架上。因为干的凝胶和_________

_______的凝胶的体积差别很大，因此装柱前需要根据色谱柱的内体积计算所需要的凝胶量。本实验使用的是交联葡聚糖凝胶(Sephadex G—75)。“G”表示凝胶的________，膨胀程度及分离范围，75表示________值，即

。凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成________悬浮液，在与色谱柱下端连接的尼龙管打开的情况下，一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时可轻轻________色谱柱，使凝胶装填均匀。注意色谱柱内不能有________存在。一旦发现气泡，必须

。装填完后，立即连接

，在约50cm高的操作压下，用300ml的物质的量浓度为20mmol/L的

充分洗涤平衡凝胶，使

。

3、样品的加入和________。

加样前，打开色谱柱下端的

，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到

，关闭出口。用

小心地将1ml

的样品加到色谱柱的顶端，注意

，加样后，

下端出口。小心加入

到适当高度，连接

打开下端出口，进行

。待

时，用试管收集流出液，每5mL收集一管，连续收集。

（三）纯度鉴定

判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯度的鉴定。在鉴定的方法中，使用最多的是___________________________________________________________________电泳。

三、操作提示1、红细胞的洗涤：洗涤次数过少，

；离心速度

会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。

2、色谱柱填料的处理：商品凝胶是干燥的颗粒，使用前需

中膨胀。为了加速膨胀，可以将洗脱液的湿凝胶用

加热，逐渐升温至

，通常只需1-2h。这种方法不但节约

，而且可以除去

。

3、凝胶色谱柱的装填：在色谱柱中装填凝胶的时候要

，以降低

。在装填凝胶柱时，不得有气泡存在。

。在凝胶色谱操作过程中，不能发生

的现象。一旦发生这种情况，

。

4、蛋白质的分离：在蛋白质分离过程中，仔细观察红色区带在洗脱过程中的移动情况。如果

，说明色谱柱制作成功。

【练习】

1.选用红细胞作为分离蛋白质的实验材料的好处是 A.血红蛋白是有色蛋白 B.红细胞无细胞核 C.红细胞蛋白质含量高 D.红细胞DNA含量高

2.血红蛋白呈红色的原因是 （ ）

A.含有O2 B.含有CO C.含有CO2 D.含有血红素

3.凝胶色谱法分离蛋白质的依据是 （ ）

A.对其他分子的亲和力 B.溶解度 C.所带电荷多少 D.相对分子质量的大小

4.缓冲液的作用是在一定范围内，抵制外界的影响来维持 A.温度基本不变 B.pH基本不变 C.渗透压基本不变 D.氧气浓度基本不变

5.使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于 A.电荷的多少 B.分子的大小 C.肽链的多少 D.分子形状的差异

6.在血红蛋白的提取和分离实验中，下列操作正确的是 A.分离红细胞时采用低速长时间离心 B.红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水就可

C.分离血红蛋白溶液是低速短时间离心 D.透析时要用20mmol/l的磷酸缓冲液，透析12h 7.血红蛋白的提取和分离中，将搅拌好的混合液转移到离心管中，离心后，可以明显看到试管中的溶液分为4层，其中第3层是 A.无色透明的甲苯层 B.脂溶性物质的沉淀层 C.血红蛋白的水溶液 D.其他杂质的暗红色沉淀物

8.（原创）凝胶柱制作的顺序一般是 （ ）

①橡皮打孔 ②挖凹穴 ③装玻璃管 ④盖尼龙网 ⑤盖尼龙纱

⑥将橡皮塞插入玻璃管 ⑦接尼龙管、装螺旋夹 ⑧柱顶安装玻璃管的橡皮塞

A.①→③→④→⑤→⑥→⑧→⑦→② B.①→②→③→④→⑤→⑥→⑦→⑧

C.①→②→③→④→⑥→⑤→⑧→⑦ D.①→②→③→⑦→⑥→⑤→⑧→④

9.（原创）对于凝胶色谱柱的装填哪项是错误的 （ ）

A.凝胶充分溶胀后配成凝胶悬浮液，在尼龙管打开的情况下一次性缓慢倒入色谱柱内

B.色谱柱内一旦发现有气泡产生就必须重装

C.装填时可轻轻敲打色谱柱，使凝胶装填均匀

D.当凝胶表面干燥后，用300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液充分洗涤

10.样品的加入和洗脱的操作不正确的是 A.加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面

B.用吸管小心的将1ml透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面

C.加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内

D.等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口

11（原创）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳在本课题中的作用是 （ ）

A.对分离的蛋白质进一步纯化 B.对分离的蛋白质的纯度进行鉴定

C.检测分离的蛋白质的活性 D.提高蛋白质的活性

12.(改编题)红细胞含有大量血红蛋白，红细胞的机能主要是由血红蛋白完成，血红蛋白的主要功能是携带氧气或二氧化碳，我们可以选用猪、牛、羊或其它脊椎动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白，请回答下列有关问题：

（1）血红蛋白提取和分离的程序可分为四步：样品处理、 、 和 。

（2）样品处理包括红细胞的洗涤、 和 三步。红细胞洗涤次数不能过少，否则 ；离心速度 和时间 会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。

（3）凝胶色谱柱在装填过程中，凝胶充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，在色谱柱下端的尼龙管的螺旋夹 的情况下，一次性缓慢倒入色谱柱内，可轻轻地敲动色谱柱，使凝胶装填均匀。

（4）右图是样品的加入与洗脱示意图，从图中可以看出，加样，正确的操作次序是 。

13.凝胶色谱法是60年代初发展起来的一种快速而又简单的分离技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果，目前已经在生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学等领域广○···

○

○·○

下列问题：

○

···

（1）a、b均为蛋白质分子，其中先从层析柱中洗脱出来的是 ，原因○是 。

○

（2）自己制作凝胶色谱柱时，在色谱柱底部d位置相当于多孔板的结构可由 替代。

（3）装填凝胶色谱柱时，色谱柱内不能有气泡的存在，原因是 。

（4）洗脱时对洗脱液的流速要求是 。

若选用SephadexG-75,则“G”表示 ；“75”表示 。

14.（改编题）右图表示血红蛋白提取和分离的部分实验装置，请回答下列问题：

（1）血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，其在红细胞中的作用体现了蛋白质具有 功能。 （2）甲装置中，B是血红蛋白溶液，则A是

。甲装置用于

甲

泛应用，不但应用于科学研究，而且已经大规模地用于工业生产。据图回答a

b

c

d 样品

样品

正确的加样操作是用吸管小心将透析后的样品

①

②

③

目的是 。

（3）用乙装置分离蛋白质的方法叫 ，是根据 分离蛋白质的有效方法。当 时，用试管收集流出液，每5mL收集一管，连续收集。

（4）判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质纯化的鉴定。在鉴定的方法中使用最多的是 凝胶电泳。 15.（改编题）红细胞含有大量血红蛋白，红细胞的机能主要是由血红蛋白完成。我们可以选用猪、牛、羊等动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白，请回答下列有关问题：

（1）实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。

①其中加入柠檬酸钠的目的是 。

②此过程是样品处理，它应包括红细胞洗涤、 、分离血红蛋白溶液。

（2）收集的血红蛋白溶液在透析袋中透析，这是样品的粗分离。

①透析的目的是 。

②透析的原理是 。

③透析袋由半透膜制成，常用的半透膜有 (至少填2个)。

（3）然后通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后经SDS—聚丙烯酰胺凝胶电脉进行纯度鉴定。其中通过凝胶色谱法将样品纯化的目的是 ；支持物电泳是目前应用较为普遍的纯化蛋白质的一种方法，支持物有 (至少填2个)。

16（改编题）试回答下列“蛋白质提取与分离实验”的有关问题：

（1）为了提取和分离血红蛋白，首先对红细胞进行洗涤以去除杂质蛋白，洗涤时应使用生理盐水而不使用蒸馏水的原因是 。

（2）若要去除血清蛋白中的小分子杂质，采用图1装置。透析液是 ，一段时间后，若向烧杯中加入双缩脲试剂，透析袋内溶液是否出现紫色并说明判断的依据： 。

（3）图4是用于分离蛋白质的凝胶色谱法柱，装填凝胶色谱柱时，色谱柱内不能有气泡的存在，原因是 。a、 。

（4）图2、图3分别表示电泳法分离蛋白质和纸层析法分离叶绿体中色素的结果。不同蛋白质得以分离是因 ；不同色素得以分离是因为 。

图1 透析袋

透析液

图2 图3 图4 ○··○·

○·○

○

○a b

b均为蛋白质分子，其中先从层析柱中洗脱出来的是 ，原因是