课题3　分解纤维素的微生物的分离教学设计模板

课题

分解纤维素的微生物的分离

一、课题目标

从土壤中分离出分解纤维素的微生物，讨论这类微生物的应用价值。

二、实验原理与设计

（一）选择培养：以纤维素粉为唯一碳源培养，增加纤维素分解菌的浓度。

（二）纤维素是由葡萄糖以β-1,4糖苷键连接而成的大分子物质。刚果红是一种染料，它可以与纤维素类多糖物质形成红色复合物，

当纤维素被纤维素酶分解后，刚果红～纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，产纤维素酶的菌株能在红色平板上形成透明圈，根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。同时可根据透明圈／菌落直径比值大小可大致反应产酶的高低。

三、材料与方法

1.土样采集 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。土样的采集要选择富含纤维素的环境，这是因为在纤维素含量丰富的环境，通常会聚集较多的分解纤维素的微生物。如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，过一个月左右也会有能分解纤维素的微生物生长。

2.选择培养

选择培养需要的仪器有：250 mL锥形瓶、无菌称量瓶、药匙、1 mL和10 mL的移液管、天平、摇床、温度计等。

培养基的制备参照课本旁栏中的比例配制。在250 mL锥形瓶中装入30 mL培养基，用8层纱布做成瓶塞，将瓶口塞紧，再在瓶塞外包裹两层包装纸（或报纸），用线绳扎紧，在121 ℃下高压蒸汽灭菌20 min。

选择培养的操作：称取土样20 g，在无菌条件下加入装有30 mL培养基的摇瓶中。将摇瓶置于摇床上，在30 ℃下振荡培养1～2 d，至培养基变混浊。此时可以吸取0.1 mL培养液进行梯度稀释和涂布平板，也可以按课本中所述，重复选择培养的步骤一次，然后再进行梯度稀释和涂布平板。

此时可将选择培养基中的纤维素粉换做葡萄糖后作为对照，判断选择培养基的作用。

3.刚果红染色法分离

纤维素分解菌这一步所需要的仪器有：无菌培养皿、涂布器、1 mL移液管，装有9mL无菌水的20 mL大试管，温箱等。

培养基的制备参照课本旁栏中的比例配制。在500 mL三角瓶中装入200 mL培养基，在121 ℃下高压蒸汽灭菌20 min。

倒平板操作：将灭菌后的固体培养基熔化，按无菌操作的要求，在无菌的培养皿中倒入15～20 mL培养基，凝固后待用。

4. 滤纸条培养基分离

滤纸条培养基

：（NH4）2SO4 1g；KH2PO4 1g；MgSO4.7H2O 0.7g；NaCl 0.5g

；蒸馏水

1000ml；滤纸条

6ⅹ1cm （厘米）（于试管中加入上述培养基5 mL，加1条滤纸(6 cm~1 cm)垂直于试管中，加塞121℃／30 min灭菌）将刚果红染色法中分离的微生物各取约0．5 cm 菌块于5 mL无菌水中制成悬浮液，分别移取1 mL菌悬液到滤纸条培养基中，于30℃避光培养，每天检查记录各菌株对滤纸条的溃烂情况。

四、结果与分析

从结果显示，选择培养基确实起到了较好的选择富集作用。待鉴别培养基上长出菌落后加入刚果红染液，出现了明显的透明圈。说明分离到了纤维素分解菌。

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五、课题延伸

（一）虽然刚果红染色法直观方便，但两种方法都有缺陷，灵敏度和准确性不高。因此，本试验采用刚果红琼脂平板培养基并结合滤纸条培养基筛选纤维素分解菌，可防止实验误差可能出现的漏选菌株。

（二）为确定得到的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验，纤维素酶的测定方法一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定。

分别取各菌株1 mm2大小的菌落接种到发酵培养基中，于摇床(29~C，160 r／min)中培养5 d。然后用滤纸过滤，静置后吸取上清液作为粗酶液备用。移取0.5 mL粗酶液于试管中，加入含05％CMC-Na的柠檬酸缓冲液1．5 mL(0．05 mol／L pH 4．5)，将试管在50℃水浴30 min后，立即按DNS法测定糖含量。

在此也可与必修教材联系：如用斐林试剂可检测是否有还原性糖产生。

（三）不同碳源对菌株纤维分解酶活力的影响

分别将筛选出的菌株各1 nlnl2大小的菌块接种到以筛选培养基的无机盐液为基础，加入2％纤维素材料作碳源(分别设稻草粉、纤维素粉、滤纸浆三个变量进行试验)的液体培养基中，于摇床(30~C，160 r／min)中培养5 d，测定酶活。

（四）不同pH值对分离菌株纤维分解酶活力的影响

以筛选培养基的无机盐液为基础，加入0．05％去氧酸钠，2％滤纸浆。以pH值为主要变量因子进行试验，分别设pH 5．5、pH 6．0、pH 6．5、pH 7．0和pH 8．0五个变量，按上法分别将筛选出的菌株接种到无机盐滤纸浆液体培养基中，于摇床(30℃，160 r／min)中培养5 d，测定其酶活。

六、课题应用价值

农作物秸秆的主要成分是纤维素，我国的纤维素资源极为丰富，每年农作物秸秆的产量达5．7x107kg，是一个巨大的可利用再生资源。在广大农村除少部分用作燃料、畜禽饲料外，大部分丢弃野外自然腐烂或焚烧，不仅造成自然资源的极大浪费，还污染了环境。如何将这些生物资源加以充分利用，一直是国内外研究的热点。采用微生物技术处理农作物秸秆是当前研究最多的一种秸秆处理方法。在纤维素的降解机理方面，国内外学者也已经进行了大量的研究，指出纤维素的降解是由纤维素酶系协同作用的结果。因此，筛选具有高活性纤维素酶的秸秆降解微生物菌株以及相关性状的研究并将其用于产酒精、H2等，对于开发新能源有着重要的意义。

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