课题3　血红蛋白的提取和分离教学设计

5.3血红蛋白的提取和分离

第2课时

学案

人教版选修一

使用说明与学法指导

1.回顾上节课凝胶色谱法和电泳的原理。

2.掌握凝胶色谱法分离蛋白质的操作以及电泳操作过程。

知识准备 凝胶色谱法和电泳的原理

教材助读

1、

蛋白质的提取和分离

蛋白质的提取分离一般分为四步： 、 、 、

。 2、

样品处理

（1）红细胞的洗涤：洗涤的目的是： ，采集的血样药及时采用 分离红细胞，然后用胶头吸管吸上层透明的 ，将下层暗红色的 倒入烧杯中，再加入 ，缓慢搅拌 ，低速短时间离心，如此重复洗涤三次直到 ，表面红细胞已洗干净。

（2）血红蛋白的释放：在 和 的作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白

（3）分离血红蛋白溶液：将搅拌好的混合溶液离心后，试管中的液体分4层，第1层为无色透明的 ，第2层为白色薄层固体是 ，第3层为红色透明液体这是 ，第4层为其他杂质的暗红色沉淀。将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。

（4）透析：取1ml血红蛋白溶液装入 中，将透析袋放入盛有300ml 20mmol/L 的 中，透析12h。透析可以去除样品中的 杂质或用于更换样品的

3、凝胶色谱操作

首先要制作 ；第二步是 ，因为 ，所以装柱前要根据色谱柱的体积计算所需要的凝胶量。在填充凝胶柱时，不得有 存在，避免降低分离效果；第三步是 。

（一）

血液的组成成分

水分

血浆

无机盐、葡萄糖等

血液 白细胞

血细胞 血小板 两个α-肽链

红细胞 血红蛋白 两个β-肽链

最多

四个亚铁红素基团

（二）实验操作

1.样品处理：通过洗涤红细胞、血红蛋白释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液。

试管中溶液层次：

- 1 -

第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）；第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）；第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）；第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）。

分离：

用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。

2.样品的粗分离

方法：透析 原理：透析袋能使小分子自由进出，而大分子保留在袋内

目的：除去样品中分子量较小的杂质。

3.样品的纯化：通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去

（1）凝胶色谱柱的制作：

①、取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。

②、底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。

注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。

③、顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。

④、组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。

⑤、安装其他附属结构

（2）凝胶色谱柱的装填

①、凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。

②、凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。

③、凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。

注意：

1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。

2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。

④、洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时。

注意：1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。

（3）样品加入与洗脱

①、调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。

②、滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。

③、样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。

④、洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。

⑤、收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）

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⑥、注意：正确的加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。

4.样品的纯化鉴定

聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定

预习自测题

1．为防止血液凝固，在采血容器中要预先加入抗凝血剂（ ）

A．NaCI B．甲苯 C．蒸馏水

D．柠檬酸钠

2．初步分离血红蛋白的实验中用到的缓冲溶液为（ ）

A．H2 CO3一NaHCO3缓冲液 B．NH4OH—NH4Cl缓冲液

C．CH3 COOH—CH3 COONa缓冲液 D．H3PO4缓冲液

课内探究

质疑探究

洗涤红细胞时为什么不能用蒸馏水代替生理盐水?

在血红蛋白释放过程中。加入蒸馏水和甲苯的目的是什么?

与其他真核细胞相比较，红细胞有什么特点？这一特点对分离有什么意义/

.实验操作中透析的目的是什么？

你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？

归纳总结

血红蛋白提取分离：首先，洗涤红细胞，释放血红蛋白、离心；然后通过透析将样品粗分离；再制作凝胶色谱柱进行样品纯化；最后，SDS凝胶电泳鉴定样品是否为血红蛋白。

知识网络图

样品处理 洗涤红细胞，释放、离心。

样品的粗分离 透析

血红蛋白的提取与分离

样品的纯化 凝胶色谱柱

样品的鉴定 SDS凝胶电泳

当堂检测 1．蛋白质提取和分离分为哪几步（ ）

A．样品处理、凝胶色谱操作、SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳

B．样品处理、凝胶色谱操作、纯化 C．样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定

D．样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定

2. 血红蛋白因含有什么物质而呈红色（ ）

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A. O2 B. CO C. CO2 D.血红素

3. 将搅拌好的混合液离心来分离血红蛋白溶液时，第二层是（ ）

A. 甲苯 B. 血红蛋白水溶液 C. 脂溶性物质的沉淀层 D. 其他杂质的沉淀

4．分离血红蛋白溶液时，离心后试管中的溶液分四层，血红蛋白位于（ ）

A．一 B．二 C．三 D．四

5. 下列操作正确的是（ ）

A. 分离红细胞时采用低速长时间离心

B. 红细胞释放出血红蛋白只需要加入蒸馏水就可

C. 分离血红蛋白溶液是低速短时间离心 D. 透析时要用20mmol/l的磷酸缓冲液，透析12h 6．洗涤红细胞的目的是（ ）

A．去除血清 B．去除杂蛋白 C．除去血小板 D．除去水

7．洗涤红细胞时，分离所用的方法为（ ）

A．低速长时间离心 B．低速短时间离心 C．高速长时间离心 D．高速短时间离心

8．制作凝胶色谱柱时，橡皮塞顶部凹穴内插入的移液管的部位及长度是（ ）

A．移液管头部5cm B．移液管尾部5cm C．移液管头部3cm D．移液管尾部3cm 9．下列有关凝胶色谱法中样品的加入和洗脱的叙述中，正确的是（ ）

A．先加入1 mL透析后的样品 B．加样前要使缓冲液缓慢下降，全部流出

C．如果红色区带均匀一致地移动，说明色谱柱制作成功

D．洗脱时可以用缓冲液也可以用清水

课后反思 请将学习总结写在下面

课后训练 一、单选题

1．装填凝胶色谱柱时，下端的尼龙管应（ ）

A．先打开后关闭 B．关闭 C．先关闭后打开 D．打开

2．D亚铁血红素基团可携带（ ）

A．一分子CO B．一分子NO C．一分子O2或CO2 D．一分子NO2

2+2+3．人体正常的血红蛋白中应含有Fe，若误食亚硝酸盐，则导致血红蛋白中的Fe。转化为3+Fe，产生高价铁血红蛋白而中毒。服用维生素C可解除亚硝酸盐中毒。在维生素C参与的反应中（ ）

A．亚硝酸盐是还原剂 B．维生素C是氧化剂 3+2+C．亚硝酸盐被氧化 D．维生素C将Fe还原为Fe

4．加有少量柠檬酸钠(防止血液凝固)的猪血分装于标号①、②、③的试管中，随后依次加入质量分数为0．3％、0．9％和1．5％的氯化钠溶液稀释，30 min后离心。下列叙述中，正确的是（ ）

A．①和②试管的上清液中有血红蛋白，沉淀中都有红细胞

B．②和③试管的上清液呈淡黄色，沉淀中均有皱缩的红细胞

C．①和③试管的沉淀中分别有红细胞的碎片和皱缩的红细胞

- 4 -

D．②和③试管的上清液是血清

5．在血红蛋白的整个提取过程中，不断用磷酸缓冲液处理的目的是（ ）

A．磷酸缓冲液会加速血红蛋白的提取过程 B．血红蛋白是一种两性物质，需要酸中和

C．防止血红蛋白被02氧化 D．让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持其结构和功能

6．在盛有红褐色的Fe(OH)3，胶体的U形管的两个管口，各插一个电极，通直流电后，发现

阴极附近的颜色逐渐加深，这说明（ ）

A．Fe(OH)3胶体粒子带正电荷，向阴极移动 B．Fe(OH)3胶体粒子带负电荷，向阳极移动

C．Fe(OH)3胶体粒子带正电荷，向阳极移动 D．Fe(OH)3胶体粒子带负电荷，向阴极移动

7. 下列有关提取和分离血红蛋白的程度叙述错误的是（ ）

A. 样品的处理就是通过一系列操作收集到血红蛋白溶液

B. 通过透析可以去除样品中分子质量较大的杂质，此为样品的粗提取

C. 可通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去，即样品的纯化

D. 可通过SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白的纯度

8. 凝胶色谱法操作正确的是（ ）

A. 将橡皮塞上部用刀切出锅底状的凹穴 B. 将橡皮塞下部切出凹穴

C. 插入的玻璃管的上部要超出橡皮塞的凹穴底面 D. 将尼龙网剪成与橡皮塞下部一样大小的圆片

9. 样品的加入和洗脱的操作不正确的是（ ）

A. 加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面下面

B. 加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内

C. 等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口

D. 用吸管小心的将1ml透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面

10. 下列说法不正确的是（ ）

A. 血红蛋白在释放时，加蒸馏水到原血液的体积，再加40％体积的甲苯，充分搅拌

B. 血红蛋白溶液离心后分为4层，第1层为白色薄层固体

C. 血红蛋白溶液离心后分为4层，第4层为暗红色沉淀物

D. 血红蛋白溶液离心后分为4层，第3层为红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液

二、多选题

11．下面关于对血红蛋白提取和分离的样品的处理措施中，正确的是（ ）

A．采集血样后要高速短时问离心获得血细胞

B．洗涤三次后如上清液仍有黄色，可增加洗涤次数，否则血浆蛋白无法除净。

C．在蒸馏水和甲苯的作用下，细胞破裂，释放出血红蛋白

D．释放血红蛋白后再经过离心，就可以使血红蛋白和其他杂质分离开来

12．凝胶色谱柱取长为40 cm，内径为1.6cm，有关说法中，正确的是（ ）

A．一般凝胶色谱柱直径的大小不影响分离的效果

B．凝胶色谱柱过高超过1 m，不影响分离的效果

C．凝胶色谱柱过矮，则影响混合物的分离度

D．凝胶色谱柱直径过大会耗用过多洗脱液，样品的稀释度过大

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