课题3　血红蛋白的提取和分离名师教学视频（文字实录）

“血红蛋白的提取和分离”教学设计

湖南省醴陵市第一中学 谢明桂

“血红蛋白的提取和分离”是人教版选修模块《生物技术实践》中的实验内容，其目的是使学生体验从复杂细胞混合物体系中提取生物大分子的基本原理、过程和方法，该实验虽然操作难度较大，但原理清晰，动手机会较多，因此，学生的学习兴趣很高。

【课题目标【

1、尝试从血液中提取和分离血红蛋白

2、了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理

【教学目标】

(1)说出从血液中初步获取血红蛋白的原理和方法。

(2)说明凝胶色谱法的原理和方法。

(3)说出电泳的基本原理和方法。

(4)进行样品的预处理。

(5)运用凝胶色谱法对血红蛋白进行分离纯化。

【教学重点和难点】

教学重点：凝胶色谱法的原理和方法。

教学难点：样品的预处理;色谱柱的装填;纯化分离操作。

【教学程序】

一、[基础知识]

1．凝胶色谱法概念、分离原理。

补充介绍：色谱法又称色谱分析、色谱分析法、层析法，是一种分离和分析方法。色谱法利用不同物质在不同相态的选择性分配，以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果。

2.

缓冲溶液

概念、作用和缓冲溶液的配制

3.

电泳

概念、分离原理、两种常用的电泳方法：琼脂糖凝胶电泳和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

二、实验操作

讨论：

为什么用猪、牛、羊的红细胞来提取血红蛋白？

（猪、牛、羊的红细胞无细胞核和众多的细胞器，结构简单，且含丰富的血红蛋白。）

蛋白质的提取和分离一般分为四步：

1.样品处理

（1）分析血浆组成

（2）介绍血红蛋白

（一）样品处理和粗提取

1.洗涤红细胞

洗涤的目的是什么？（去除杂蛋白，以利于后续步骤的分离纯化）

洗涤过程（如图）：

讨论

（1）洗涤时能用蒸馏水代替生理盐水吗？

（不能。生理盐水能保持红细胞的渗透压稳定而不至于破裂，在未洗净血浆中的杂蛋白之前，红细胞如果提前破裂，就可能使血红蛋白与杂蛋白混在一起，加大了分离的难度。）

（2）洗涤次数太少，可能有什么后果？

（会导致无法除去血浆蛋白）

（3）离心速度过高或时间过长，可能有什么后果？

（会使白细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。）

2.释放血红蛋白

阅读思考：

1. 释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？

2. 为了加速释放过程，采取了下列措施，思考各自的作用。

（蒸馏水的作用是：使红细胞大量吸水胀裂；

加入甲苯的作用是：溶解红细胞的细胞膜；

充分搅拌的目的是：加速红细胞的破裂。）

3.分离血红蛋白

将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性物质沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。

4.透析（粗分离）：

将血红蛋白溶液装入透析袋并置于磷酸缓冲液中（pH为7.0）透析12小时。

目的：除去分子较小的杂质。

(二)纯化－－凝胶色谱操作

1.凝胶色谱柱的制作

2.凝胶色谱柱的装填：①固定→②装填→③洗涤平衡 3.样品的加入和洗脱

注意：

1、凝胶色谱柱的装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的间隙。

2、在装填凝胶色谱柱时，不得有气泡存在，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。

(三)鉴定－－凝胶电泳

【巩固练习】 1、红细胞含有大量血红蛋白，红细胞的机能主要是由血红蛋白完成，血红蛋白的主要功能是携带O2或CO2，我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白。请回答下列有关问题： （1）血红蛋白的提取和分离一般可分为四步： 、 、

和 。

（2）实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，取血回来，马上进行离心，收集血红蛋白溶液。

①

加入柠檬酸钠的目的是 ②以上所述的过程即是样品处理，它包括 、 、

分离血红蛋白溶液、透析。

（3）收集的血红蛋白溶液在透析袋中可以经过透析，这就是样品的粗分离。

①透析的目的是 。

②透析的原理是 。

（4）然后通过凝胶色谱法将样品进一步纯化，最后经SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。样品纯化的目的是 。

2、电泳利用了待分离样品中各种分子 以及 、 的不同，使带电分子产生不同的迁移速率，从而实现样品中各种分子的分离。

3、（12分）红细胞含有大量血红蛋白，红细胞的机能主要是由血红蛋白完成，血红蛋白的主要功能是携带O2和CO2，我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验，来提取和分离血红蛋白。请回答下列有关问题：

（1）实验前取新鲜的血液，要切记在采血容器中预先加入柠檬酸钠，加入柠檬酸钠的目的是_____________。洗涤红细胞时要用______ （填溶液）反复洗涤、离心。要让红细胞破裂，释放血红蛋白时要加入_________ 。

（2）

得到的血红蛋白溶液装入透析袋中透析，即血红蛋白的粗分离，目的是除去_______ 。

（3）然后通过_____ （填方法）将样品进一步纯化，最后进行纯度鉴定，使用最多的是______ （填方法）。

答案：23. （1）样品处理 粗分离 纯化 纯度鉴定

（2）①防止血液的凝固②红细胞的洗涤 血红蛋白的释放

（3）①去除样品中分子量较小的杂质蛋白除去

②透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内

（4）通过凝胶色谱法将相对分子质量大的杂质蛋白除去

24. 带电性质的差异；分子本身的大小；形状的不同

25【答案】（1）防止血液凝固 生理盐水 蒸馏水和甲苯

（2）去除样品中相对分子质量较小的杂质

（3）凝胶色谱法 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

【解析】（1）提取和分离血红蛋白时，新鲜的血液加入柠檬酸钠的目的是防止血液凝固。洗涤红细胞时要用生理盐水反复洗涤、离心。要让红细胞破裂，释放血红蛋白时要加入蒸馏水和甲苯。

（2）得到的血红蛋白溶液装入透析袋中透析，即血红蛋白的粗分离，目的是除去样品中相对分子质量较小的杂质。

（3）通过凝胶色谱法可将样品进一步纯化，最后进行纯度鉴定，使用最多的是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。