课题3　血红蛋白的提取和分离教学设计第一课时

专题5 DNA和蛋白质技术

课题3《血红蛋白的提取和分离》第二学时教学设计

一、教学目标

（一）知识目标

1、尝试从血液中提取和分离血红蛋白

（二）能力目标

体验血红蛋白提取和分离的实验的严格要求 （三）情感目标

初步形成科学的思维方式，发展科学素养和人文精神

二、教学重点和难点：

教学重点：掌握《血红蛋白提取和分离》的基本过程和方法，细化过程

教学难点：样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填

二、教学过程 （一）、回顾旧知导入新课

1.

分离纯化蛋白质的方法？

2.

凝胶色谱法分离纯化蛋白质的原理？

3.

如何鉴定分离纯化得到的蛋白质是目的蛋白？

（二）、血红蛋白的提取和分离实验设计

2.1蛋白质的提取和分离一般分为哪些基本步骤？

样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定。

思考：是否所有种类的蛋白质的提取和分离都是这样的？为什么？

不是。因为蛋白质的来源和性质不同，分离方法差别很大。

2.2选择实验材料

（1）能不能用鸡，鸭的红细胞提取血红蛋白？最好哪种血液来提取血红蛋白？为什么？

鸡，鸭的红细胞具有细胞核，和众多的细胞器，结构复杂；哺乳动物成熟的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。

（2）认识哺乳动物血液组成及血红蛋白性质。

1.血液由血浆和血细胞两部分组成。

2．血细胞中红细胞细胞数量最多，细胞的含量最高的化合物是血红蛋白。

3.该化合物是由两个α－肽链、两个β－肽链和四个亚铁红素基团构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的亚铁红素基团。

2.3从红细胞中分离出血红蛋白的过程为：

洗涤红细胞、释放血红蛋白、分离血红蛋白、透析。

阅读思考：洗涤的目的是什么？洗涤的方法是什么？洗涤干净的标志是什么？

红细胞的洗涤过程为：血液＋柠檬酸钠→低速短时离心→吸出上层血浆→红细胞＋5倍体积生理盐水→缓慢搅拌10min→低速短时离心→吸出上清液→反复洗涤直至上清液无黄色

洗涤的目的：除去血浆蛋白的杂蛋白，有利于后续步骤的分离纯化。

加入柠檬酸钠的目的：防止血液凝固；

洗涤的方法：低速短时离心

思考：能否采用高速长时间离心？

速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果

洗涤干净的标志：重复洗涤3次，直至上清液没有黄色

阅读思考：释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？

为了加速释放过程，采取了什么措施？

蒸馏水的作用是______________________________。

加入甲苯的作用是____________________________。

充分搅拌的目的是____________________________ 补充：加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。加入甲苯的目的是溶解细胞膜，有利于血红蛋白的释放和分离。此时，红细胞破碎混合液中不仅含有血红蛋白，而且还含有细胞破碎物、脂质、甲苯有机溶剂等。怎样除去这些杂质呢？由于它们的密度不同，科学家采取了离心分离的方法：

10min）→滤纸红细胞破碎混合液→高速长时离心（2000c/min×过滤除去脂质→分液漏斗分离出血红蛋白

2.4如何除无机盐离子和小分子有机物质呢？

透析目的：除去样品中分子量较小的杂质。

在透析过程中，取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时。

思考：为何使用pH＝7的磷酸缓冲液？

维持血红蛋白的正常特性。

总结：通过以上四个基本过程，红细胞中的血红蛋白就被提取出来。但其中还含有其他种类的蛋白质分子（如呼吸酶等）。怎样将杂蛋白与血红蛋白分离开来呢？我们来研究蛋白质提取和分离的第二个步骤――粗分离（凝胶色谱操作）。

2.5凝胶色谱分离蛋白质包括：制作色谱柱、装填色谱柱、样品加入和洗脱。

色谱柱的制作过程：准备材料→加工橡皮塞→安装色谱柱

下面进行第二步凝胶色谱柱的装填。请阅读教材：

色谱柱的装填过程。

请同学们阅读教材中样品加入和洗脱相关内容。思考其基本过程及注意事项，并完成课前发给大家的知识清单。

①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。

②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。

③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口

④洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。

⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）

至此，血红蛋白即可得到粗分离。在整个操作过程中，应当注意以下事项：

（1）凝胶的预处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。

（2）色谱柱的装填：凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。

装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。

（3）洗涤平衡：1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象

（三）、实验结果分析与评价

1、在血红蛋白纯化的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？

让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能正常。

2、与其他蛋白质相比，血红蛋白有什么特点？这一特点对你进行血红蛋白的分离有什么启示？

血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。 三、

课堂小结 你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？

1.样品的处理——通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液

2.样品的粗分离——经过透析去除分子量较小的杂质

3.样品的纯化——通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去

4.经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。

四、板书

5.3 血红蛋白质的提取和分离

二、血红蛋白的提取和分离实验设计

样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定。

三、实验结果分析与评价

五、反馈练习

知识清单相关练习