课题3　分解纤维素的微生物的分离优秀完整教案

课题3 分解纤维素的微生物的分离

纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，植物每年产生的纤维素超过70亿吨。

农作物秸秆：米秸、麦秸、稻草、草、木屑

等富含大量的纤维素，被利用的机会很少、效率低；

在草食性动物等的消化道内，也共生有分解纤维素的微生物，其原理也是产生纤维素酶而分解纤维素，而人没有分解纤维素的能力；

土壤中的某些微生物能分解利用纤维素。

教学目标

1、知道纤维素酶的种类及作用

2、初步掌握从土壤中分离出分解纤维素的微生物的实验方法

一、基础知识

1.什么是纤维素？在生物圈的分布状况？

2.什么是纤维素酶？包括哪些组分及作用？

3.纤维素分解菌的筛选方法及原理？

1.纤维素

纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是含量最丰富的多糖类物质。

植物的根、茎、叶等器官都含有大量的纤维素。

棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物。

土壤中某些微生物能够产生纤维素酶,把纤维素分解为葡萄糖，后再利用。

2.纤维素酶

纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即：C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。

〖思考1〗实验分析：P27的小实验是如何构成对照的？

在一支试管中添加纤维素酶，

另一支试管不添加纤维素酶；

3、纤维素分解菌的筛选

（1）筛选纤维素分解菌的方法__刚果红染色法__。该方法可以通过__颜色__反应直接筛选。

（2）原理：

刚果红是一种染料，它可以与纤维素形成红色复合物，但并不和纤维二糖、葡萄糖发生这种反应。在含有纤维素的培养基中加入刚果红时，刚果红与纤维素形成红色复合物。当纤维素被纤维素酶分解后刚果红—纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解菌为中心的透明圈

。这样我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。可根据是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌

二、实验设计

1.实验原理

纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括三种组分，即CX酶、 C1酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。

刚果红染色法：这种方法能够通过颜色反应直接对微生物进行筛选。

刚果红是一种染料，它可以与纤维素形成红色复合物，但并不和纤维二糖、葡萄糖发生这种反应。当纤维素被纤维素酶分解后刚果红—纤维素的复合物就无法形成，培养基中会出现以纤维素分解为中心的透明圈

。这样我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

2.实验流程

1

3.实验步聚

（1）土壤取样

（2）选择培养 选择培养基的制备、选择培养的操作

（3）梯度稀释 制备菌悬液

（4）将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上

制备鉴别纤维素分解菌的培养基、倒平板、涂布平板

（5）挑选产生透明圈的菌落 刚果红染色法

4.具体操作

（1）土壤取样

a.取样的环境是怎样的，作出这种选择的理由是什么？

（为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？）

选择纤维素丰富的环境，如树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等等。

生物与环境的互相依存关系，在富含纤维素的环境中纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土壤中获得目的微生物的几率要高于普通环境。

b.将滤纸埋在土壤中有什么作用？

人工设置适宜环境，使纤维素分解菌相对聚集。

c.你认为滤纸应该埋进土壤多深？为什么？

将纸埋于深约10cm的腐殖土壤中。

根据树叶腐烂程度推测出的，一般埋10cm左右，能使纤维素分解菌相对聚集。其次，纤维素分解菌是一类细菌，有的好氧，有的不好氧，所以这个深度不会太深或太浅。

（2）选择培养

a.选择培养的目的：

增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物

b.制备选择培养基

参照课本29页旁栏中的比例配置，回答下列问题

(a)旁栏中的配方是液体培养基还是固体培养基？为什么？

是液体培养基，原因是配方中无凝固剂

(b)这个培养基对微生物是否具有选择作用？如果具

有，是如何进行选择的？

有选择作用，本配方中的碳源是纤维素粉，为唯一碳源，所以能分解纤维素的

微生物可以大量繁殖

(c)你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用

用牛肉膏蛋白胨培养基与之对照

或者将纤维素改为葡萄糖。

(d)配方中的酵母膏也能够提供少量的碳源，会对纤维素分解菌的培养造成怎样的影响？

由于酵母膏的含量极少，其他微生物也能在该培养基中生长繁殖，但很少。然而，只有以纤维素为

碳源的微生物才能大量繁殖。

c.为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？

在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此选择培养可以起到“浓缩”所需微生物的作用。

d.具体操作

按配方配制，在250ML锥形瓶中装入30ML培养基，用纱布做成瓶塞，瓶塞外包裹包装纸，扎紧，高压蒸汽灭菌。

2

称取土样20g，在无菌条件下，将土样加入装有30ml选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下振荡培养1～2天，直至培养液变浑浊。

吸取一定量的培养液，转移至新的选择培养基中，同样培养至变浑浊。

（3）梯度稀释

制备菌悬液 按照课题1的稀释操作方法，将选择培养后的培养液进行等比稀释，稀释最大倍数

6 到10

（4）将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上

制备鉴别纤维素分解菌的培养基

鉴别纤维素分解菌的培养基配方

培养基组成

CMC-Na(水溶性羧甲基纤维素钠)

5~10g 酵母膏 1g KH2PO4

0.25g 土豆汁 100mL 琼脂 15g 上述物质溶解后，加蒸馏水定容至1000mL 提供的主要营养物质

碳源

碳源、氮源、生长因子

无机盐

碳源、生长因子

凝固剂

氢元素、氧元素

倒平板

涂布平板

46将稀释度为10～10的菌悬液各取0.1ml涂布在培养基上，30℃倒置培养，至菌落长出。每个稀释度下涂布3个平板，设置对照。

（5）挑选产生透明圈的菌落

刚果红染色法

方法一：先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应

方法二：在倒平板时就加入刚果红

挑取产生明显的透明圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落。

思考：这两种方法各有哪些优点与不足

染色法

优点

缺点

操作繁琐，刚果红会使菌落之间发生混杂

由于培养基中还含有淀粉类物质，可以使能产生淀粉酶的微生物出现假颜色反应；

有些微生物具有降解色素的能力，它们在长时间培养过程中会降解刚果红，形成明显的透明圈，与纤维素分解菌不易区分。

方法一

颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用

方法二

操作简便，不存在菌落混杂问题

（6）纯化纤维素分解菌及保存

接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在300C－ 370C培养，纯化培养。

思考：本实验的流程与课题2中的实验流程有哪些异同？ 本实验流程与课题2的流程的区别如下。课题2是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为唯一氮源的选择培养基上，直接分离得到菌落。

本课题通过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，再将菌液涂布在选择培养基上。其他步骤基本一致。

三、结果分析与评价

1.培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落？

对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。

如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。

3

为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行_发酵产纤维素酶_实验，纤维素酶的发酵方法有_ 液体 发酵

和_ 固体 发酵。纤维素酶测定方法是对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的_

葡萄糖

含量进行定量测定。

四、小结

4