课题3　血红蛋白的提取和分离教学目标

血红蛋白的提取和分离 教学设计

教学目标

1、体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。了解提取植物芳香油的基本原理

2、了解提取植物芳香油的基本原理

3、掌握凝胶色谱法、电泳法、缓冲溶液、凝胶色谱法分离蛋白质的原理、电泳法分离样品的原理、缓冲溶液的组成和作用机理

教学重点、难点

重点：凝胶色谱法的原理和方法

难点：

①样品的处理

②色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。

教学设想

1、课时安排：

3课时

2、方法、准备

（1）启发式教学

（2）传统教学与多媒体相结合

第一课时

教学要点：

教学内容及步骤：

一、导入：

蛋白质是生命活动不可缺少的物质。随着人类基因组计划的进展以及多种生物基因组测序工作的相继完成，人类跨入了后基因组和蛋白质组时代对蛋白质的研究与应用，首先需要获得纯度较高的蛋白质。因此从复杂的细胞混合物中提取、分离高纯度的蛋白质是生物科学研究中经常要做的工作血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，负责血液中O2和CO2的运输。在本课题中，我们将以血红蛋白为实验材料，学习蛋白质提取和分离的一些基本技术。 二、具体教学过程

思考：

“课题1--DNA的粗提取与鉴定”

实验理想的材料是什么？

“课题3--血红蛋白的提取和分离”这实验理想的材料又是什么？原因是？

答：鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，哺乳类动物成熟的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。

一、基础知识

1.蛋白质分离的原理：

根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。

（一）

凝胶色谱法（分配色谱法）

1.概念：

根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶，来进行分离。

2.凝胶：

大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。

琼脂糖：用琼脂为原料经加工精制的大分子凝胶

3、凝胶色谱法的原理

①相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢; ②相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。

相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。

进行体外实验时，如何保证蛋白质不会发生变性呢？

（二）缓冲溶液

1.作用:能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响，维持PH基本不变。

2.缓冲溶液的配制:通常由1－2 种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。

3. 在本课题中使用的缓冲液是:磷酸缓冲液,成分：磷酸二氢钠与磷酸氢二钠

如何证明色谱法获得的蛋白质是目的蛋白？

（三）

电泳：

1.概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。

2.原理：

①许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。

②在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。

③电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。

3.类型:琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。

影响蛋白质分子运动速度的因素

聚丙烯酰胺凝胶电泳：

1、在测定蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸钠（SDS）—聚丙烯酰胺凝胶电泳。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N’-亚甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。

2.原理：蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。

3. SDS作用机理: SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。

SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量

讨论：如何测定蛋白质的分子量？

使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的分子量。市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售。

缓冲溶液：

在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。

作用：

能够抵制外界的酸或碱对溶液的PH值的影响，维持PH基本不变。

配制：

通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。

常用：

NaH2PO4 / Na2HPO4

H2CO3/NaHCO3 思考：

你认为在血红蛋白整个实验中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？

磷酸缓冲液；目的：是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科学研究(活性)。

在生物化学的研究工作，为什么要配制缓冲溶液和准确测定缓冲溶液的pH？

生物体内进行的各种生物化学反应都是在一定的pH下进行的，为了能够在实验室条件下准确模拟生物体内的过程就必须保持体外的pH与体内的基本一致。因此，缓冲溶液的正确配制和pH的准确测定，在生物化学的研究工作中有着极其重要的意义。

二、实验操作

（一）蛋白质提取和分离步骤

样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定

血液有哪些成分？

用鸡的红细胞提取DNA，用猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？

鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。

血红蛋白的特点：每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。

（二）操作过程

1.样品处理和粗分离：

（1）洗

涤

红

细

胞

阅读思考：洗涤的目的是什么？洗涤的方法是什么？洗涤干净的标志是什么？

(1)红细胞的洗涤: ①洗涤目的: 去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化，洗涤次数不可过少。

②洗涤操作：

1、采集血样。

2、低速短时间离心（速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果）

3、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。

4、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤(生理盐水)。

5、低速离心（低速短时间）

6、重复4、5步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干净。

洗涤方法：

采用低速短时间离心，如500r／min,离心2min然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水(质量分数为0.9％的NaCl溶液)，缓慢搅拌10min，低速短时间离心，如此重复洗涤三次直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。

思考：能否用蒸馏水代替生理盐水？

不能；生理盐水能保持红细胞的渗透压而不至于破裂，若红细胞提前破裂，使血红蛋白与杂质血浆蛋白混在一起加大分离难度。

（2）释放血红蛋白

阅读思考：

1、释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质？

2、为了加速释放过程，采取了什么措施？

目的分析：

蒸馏水的作用是使红细胞大量吸水胀裂

加入甲苯的作用是溶解红细胞的细胞膜

充分搅拌的目的是加速红细胞的破裂

为什么加入甲苯而不是其他的无机溶剂？

（3）分离血红蛋白

(3)

分离血红蛋白溶液：

①过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min。

②试管中溶液层次：

第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）；

第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色）；

第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色)；

第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）。

③分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。

(4)透

析：

①过程：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时。

②透析目的：除去样品中分子量较小的杂质。

1、透析袋的本质是什么？

半透膜：玻璃纸、肠衣、膀胱膜。

2、透析的原理？

透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。

2.凝胶色谱操作: （1）凝胶色谱柱的制作：

①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。⑤安装其他附属结构。

（2）凝胶色谱柱的装填

①凝胶的选择：

A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。

B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。

②凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。

③凝胶色谱柱的装填方法：

A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。

B、装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。

注意：

1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。

（2）凝胶色谱柱的装填

④洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时。

注意：1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。

（3）样品加入与洗脱

①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。

②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。

（3）样品加入与洗脱

注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。

③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口

④洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。

⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）

思考下面的问题：

1、在血红蛋白纯化的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？

让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能正常。

2、与其他蛋白质相比，血红蛋白有什么特点？这一特点对你进行血红蛋白的分离有什么启示？

血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。

（三）SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做）

1.目的：鉴定血红蛋白纯度。

三、实验结果分析与评价

1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？

观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。

2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？

由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖—2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。

3、你能观察到蛋白质的分离过程中红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？

如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。

3.凝胶色谱法分离蛋白质的具体过程

用SDS测定蛋白质分子量的方法

使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，可以测定未知蛋白质的分子量。市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售。

三、本节课小结：

小结：你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？

1.样品的处理——通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液

2.样品的粗分离——经过透析去除分子量较小的杂质

3.样品的纯化——通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去

4.经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。

四、作业布置

1、

步步高导学案

2、步步高课时作业

五、板书设计

5-3血红蛋白的提取和分离

一、基础知识

1.蛋白质分离的原理：

（一）

凝胶色谱法（分配色谱法）

1.概念：

2.凝胶：琼脂糖：用琼脂为原料经加工精制的大分子凝胶

3、凝胶色谱法的原理

①相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢; ②相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。

（二）缓冲溶液

1.作用:能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响，维持PH基本不变。

2.缓冲溶液的配制:通常由1－2 种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。

3. 在本课题中使用的缓冲液是:磷酸缓冲液,成分：磷酸二氢钠与磷酸氢二钠

（三）

电泳：

1.概念：带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。

2.原理：

3.类型:琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。

二、实验操作

（一）蛋白质提取和分离步骤

样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定

六、教学反思