课题2　多聚酶链式反应扩增DNA片段优秀公开课教案

选修1专题5课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段教案

一、课题目标

1.知识目标

理解PCR的原理和反应过程。

2.能力目标

尝试PCR技术的基本操作

3.情感目标

通过讨论PCR技术的应用，体会科学技术在生活中的实际运用。

二、课题重点

PCR的原理和基本操作。

三、课题难点

PCR的原理。

四

教学流程

教学流程

环节一：课程导入

在刑事侦破案件中常需要对样品DNA进行分析，PCR技术能快速扩增DNA片

段，在几个小时内复制出上百万份的DNA拷贝，有效地解决了因为样品中DNA含量太低而难以对样品进行分析研究的问题。现在PCR技术已广泛应用于遗传病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和基因测序。

课题目标

1.理解PCR的原理和反应过程

；

2.尝试PCR技术的基本操作； 3.讨论PCR技术的应用。

环节二：讲授新课

一、基础知识

(一）PCR原理

1.胞内DNA复制的基本体系

引导学生回忆DNA复制相关知识，完成以下表格。

参与组分

在DNA复制中的作用

原理和反应过程。

1 教师活动

学生活动

设计意图

情景导入本节目标。

展示课题背景，导入课题目标。

课题背景

阅读、倾听。

回忆、回答。

理解PCR的

解旋酶

DNA母链

打开DNA双链

提供DNA复制的模板

观察、思考、回

2 4种脱氧核苷酸

合成子链的原料

DNA聚合酶

引物

催化合成DNA子链

使DNA聚合酶能够从引物的3´端开始连接脱氧核苷酸

2.DNA双链方向与复制关系

引导学生观察教材图5-6 DNA复制方向的示意图，讲解DNA的3´端和5´端，答。

DNA聚合酶的特性以及DNA复制方向。

（1）DNA的羟基“－OH”末端称为3’端，而磷酸基团的末端称为5’端。

（2）DNA聚合酶只能从3 ´端延伸DNA链，故DNA复制需要引物。

（3）DNA合成总是从子链的5 ´端向3 ´端伸。

3.PCR原理

联系DNA复制相关知识，讲解 PCR原理，并且与细胞内DNA复制比较。

（1）DNA的热变性原理 通过控制温度来控制双链的解聚与结合。

倾听、思考、回答，

①变性：80－100°C的温度范围内， DNA双螺旋结构解体，双链分开 ②复性：

温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链重新结合成双链 （2）耐高温的Taq DNA聚合酶 （3）缓冲液为PCR反应提供的物质

DNA模板，分别与两条模板链相结合的两种引物，四种脱氧核苷酸，耐热的DNA聚合酶，同时通过控制温度使DNA复制在体外反复进行。

【方法点拨】细胞内复制和PCR不同点

① PCR过程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA单链，其长度通常为20－30个脱氧核苷酸

② PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现

观察、思考、回

的

（二）PCR的反应过程

引导学生观察教材图5-9 PCR过程图解，理解PCR过程，加以点拨，共同归纳总结。

PCR一般要经历三十多次循环，每次循环分为变性、复性和延伸三步。

(1)变性 温度上升到90 ℃以上时，双链DNA解旋为单链。 答。

演练、回答。

3 (2)复性 温度下降到50 ℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合。 (3)延伸

温度上升到72 ℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、C、G)在DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。

【方法点拨】 (1)72 ℃左右时，TaqDNA聚合酶有最大活性，可使DNA新链由5′端向3′端延伸。

(2)DNA聚合酶只能特异性地复制处于两个引物之间的DNA序列，使该段固定长度的序列呈“指数式”扩增。

【典型例题】 PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比，主要有两点不同，它们是（ ）

①PCR过程需要的引物是人工合成的单链DNA或RNA ②PCR过程不需要DNA聚合酶

③PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的

④PCR过程中，DNA不需要解旋，直接以双链DNA为模板进行复制

A．③④ B．①② C．①③ D．②④

【答案】C 二、实验操作

（一）设备及用具

结合实际图解讲解实验操作设备及用具的相关用途。

1.PCR仪

一台能够自动调控温度的仪器

2.微量离心管

一种薄壁塑料管，总容积为0.5ml 3.微量移液器

用于定量转移PCR配方中的液体，其上的一次性吸液枪头用一次更换一次

（二）实验操作步骤

讲解实验操作步骤以及注意事项。

1.准备

按照PCR反应体系的配方将所需用的试剂摆放在实验桌上。

2.移液

用微量移液器按照PCR反应体系配方往微量离心管里面加入各种试剂。

3.混合

①过程：盖严微量离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁。

②注意: A.离心管口的盖子一定盖严，防止实验中脱落或液体外溢。

B.手指轻轻弹击微量离心管的管壁，目的是使反应液混合均匀。

4.离心

①过程：将微量离心管放在离心机上,离心约10s。

②目的：使反应液体集中在离心管底部，提高反应效果。

5.反应

将离心管放入PCR仪上，设置好PCR仪的循环程序。

循环数

变性

复性

延伸

倾听、思考、回答。

尝试PCR技术的基本操作。

4 第一次

94°C，10min －

９4℃，30s －

30次

55℃，30s 72℃，1min 最后一次

９4℃，1min 55℃，30s 72℃，1min

【注意事项】

避免外源DNA等因素的污染 ①隔离操作区，所用微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用必须进行高压灭菌；

②分装试剂，简化操作程序，使用一次性枪头。

【典型例题】 在PCR实验操作中，下列说法不正确的是(

) A．在微量离心管中添加各种试剂时，只需一个枪头

B．离心管的盖子一定要盖严，防止液体外溢

C．用手轻弹离心管壁的目的是使反应液充分混合

D．离心的目的是使反应液集中在离心管部，提高反应效果

【答案】A 【方法点拨】 1.在微量离心管中添加各种试剂时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头必须更换，以确保实验的准确性；

2.离心管的盖子一定要盖严，防止实验中脱落或液体外溢；

3.离心10s的目的是使反应液集中在离心管部，提高反应效果。

三、课题成果评价

（一）理论上DNA扩增数目的计算

引导学生根据DNA复制相关知识推导计算公式。

1.一条DNA，复制n次， DNA为2

2.a条DNA，复制n次， DNA为a ×2

（二）实验中DNA含量的测定

讲解实验中DNA含量测定的原理和过程。

1.原理

可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果，DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关。

2.过程

①稀释

2uLPCR反应液，加入98uL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释。

②对照调零

以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零。

③计算

取DNA稀释液100uL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值。

nn

演练、回答。

推导公式。

理解DNA含量测定的原理和过程。

5

④计算

DNA含量（g）＝50 x(260nm的读数）x 稀释倍数

四、

课题延伸

讲解：PCR技术是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。

它具有特异、敏感、产率高、

快速、

简便、重复性好、易自动化等突出特点。

例如：PCR产物每轮循环增加一倍，30轮循环扩增量达2个拷贝（10拷贝）。

环节三：课堂小结

共同回顾本节要点：

一、PCR原理

1.变性：温度上升到90 ℃(90～96 ℃)以上时，双链DNA解旋为单链

2.复性：温度下降到50 ℃(40～60 ℃)左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合

3.延伸：溶液中的四种脱氧核苷酸(A、T、C、G)在Taq DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链

二、PCR操作

1.准备

2.移液

3.混合

4.离心

5.反应

呼应、回答。

突出本节重点。

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