课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数教案和课堂实录

高二生物

选修一

2019.4.11 专题2 课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

预习与课堂探究案（一课时）

班级 姓名 学号 完成情况

知识点一

特殊细菌的分离与计数的研究思路

【学习任务1】阅读教材P21~23页内容，完成以下知识梳理。

1．筛选菌株

微生物筛选的原理：人为提供有利于 生长的条件(包括 、 、 等)，同时 或 其他微生物的生长，该类培养基是 培养基。 2．统计菌落数目

(1)统计菌落数目的常用方法： 。

(2)统计依据：当样品的 足够高时，培养基表面生长的一个 ，来源于样品稀释液中的一个 。通过统计平板上的 ，能推测出样品中大约含多少活菌。

3．设置对照：排除实验组中 对实验结果的影响，提高实验结果的 。

【学习任务2】分析实例，理解如何通过实验进行特定种类细菌的分离与计数。

1．自然界中目的菌株的筛选

如图是美国黄石国家公园的一个热泉，从耐热细菌中分离到耐高温的TaqDNA聚合酶。

(1)实例：DNA多聚酶链式反应(PCR)是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，此项技术要求使用耐高温(93 ℃左右)的 。

(2)Taq细菌能从热泉中被筛选出来的原因：热泉温度70～80 ℃，淘汰了绝大多数微生物，而使 被筛选出来。

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2019.4.11 (3)自然界中目的菌株的筛选依据：寻找目的菌种时要根据它对 的要求，到相应的环境中去寻找。

2．实验室中目的菌株的筛选

(1)原理：人为提供有利于 生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时 其他微生物的生长。

(2)方法：利用 培养基分离。

(3)选择培养基

①概念：允许 的微生物生长，同时 其他种类微生物生长的培养基。

②下面是本课题使用的培养基的配方，请分析：

KH2PO4

Na2HPO4

MgSO4·7H2O 葡萄糖

尿素

琼脂

将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL

a.由于加入了凝固剂 ，从物理性质看此培养基属于 培养基，从功能上看属于 培养基。

b．在该培养基的配方中，碳源是 ，氮源是 。

c．绝大多数微生物都能利用 ，只有能合成 的微生物才能分解尿素。以尿素为唯一氮源的培养基可以分离得到产生 的微生物(即分解尿素的微生物)。

3．统计菌落数目

常用来统计样品中活菌数目的方法是 。

(1)统计菌落数目

①稀释：当样品的 足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的 。

②计数：一般选择菌落数在 的平板进行计数。

③统计：通过统计平板上的 ，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为使结果接近真实值，可将同一稀释度加到三个或三个以上的平板中，经涂布，培养计算出菌落2

1.4 g

2.1 g 0.2 g 10.0 g 1.0 g 15.0 g

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2019.4.11 平均数。

(2)活菌数的计算方法(公式)：每克样品中的菌株数＝ ，C表示： ；V表示： ；M表示 。

4．设置对照

(1)设置对照的主要目的是排除实验组中 因素对实验结果的影响，提高实验结果的 。

(2)设置对照的方法：

① 对照：不给对照组任何处理因素；

② 对照：给对照组施以部分实验因素，但不是所要研究的处理因素；

③ 对照：对照组和实验组都在同一研究对象上进行；

④ 对照：不单设对照组，而是几个实验组相互对照。

(3)教材P22～23提供的案例中A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。一是由于 ，二是由于 。如何设置对照实验来确定原因？

方案一： . 。

方案二： . 。

【拓展】

显微镜直接计数也是测定微生物数量的常用方法（回顾必修三P68页“培养液中酵母菌种群数量的变化”实验）

(1)原理：此法利用特定的细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量，但不能区分细菌的死活。计数板是一块特制的载玻片，上面有一个特定的底面积为1 mm2高为0.1 mm的计数室，1 mm2的底面积又被划分成25个(或16个)中格，每个中格进一步划分成16个(或25个)小格，计数室由400个小格组成。

(2)操作：盖上盖玻片，将稀释的样品滴在计数板上，然后在显微镜下计数4～5个中格中的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再按公式求出每毫升样品中所含的细菌数。

(3)计数公式：每毫升原液所含细菌数＝每小格平均细菌数×400×10 000×稀释倍数。

(4)缺点：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察。

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2019.4.11 ★【总结】用稀释涂布平板法对微生物进行计数时的注意事项

(1)为了保证结果准确，一般设置 个平板，选择菌落数在 的平板进行计数，并取其 。

(2)统计的菌落数往往比活菌的实际数目 ，原因是 。因此，统计结果一般用 而不是活菌数来表示。

【跟踪检测1】自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题：

实验步骤：

(1)制备稀释倍数为10、10、10、10、10的系列稀释液。

(2)选用 法接种样品。

(3)适宜温度下培养。

结果分析：

(1)要从多种细菌中分离某种细菌，培养基要用(

) A．加入青霉素的培养基 B．固体培养基

C．液体培养基 D．加入高浓度食盐的培养基

(2)测定的大肠杆菌数，在对应稀释倍数为10的培养基中，得到以下几种统计结果，正确可信的是(

) A．一个平板，统计的菌落数是23 B．两个平板，统计的菌落数分别是22和26，取平均值24 C．三个平板，统计的菌落数分别是21、5和52，取平均值26 D．四个平板，统计的菌落数分别是21、30、24和25，取平均值25 (3)一同学在稀释倍数为10的培养基中测得平板上菌落数的平均值为23.4，那么每毫升样品中的菌株数是(涂布平板时所用稀释液的体积为0.2 mL)________。

(4)用这种方法测定大肠杆菌数量，实际活菌数量要比测得的数量________，因为________________________________________________________________________。

(5)某同学在测定大肠杆菌的密度时发现，在培养基上还有其他杂菌的菌落，能否肯定该大肠杆菌的品系被污染了？为什么？_________________________________________。

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2019.4.11 知识点二

土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的实验设计

【学习任务3】阅读教材P23~26页内容，完成以下的知识梳理。

（一）实验设计（阅读教材P23～24）

操作步骤：土壤取样→ →微生物的 。

1．土壤取样一般要铲去 ，因为绝大多数细菌分布于距地表约 的土壤层。

2．样品的稀释：不同的微生物需要稀释的倍数不同，请填写下表

微生物

稀释倍数

3.微生物的培养与观察

微生物的生长受 的影响，菌落的 和 是观察的主要内容。

（二）操作提示（阅读教材P25～26）

1．无菌操作：取土样用的 和盛土样的 都要进行灭菌。称取土样要在 旁进行。稀释样品要在 旁操作。

2．做标记：对 和试管进行标记，尤其进行系列稀释时要按照 的顺序将试管排列成行。

（三）课题延伸（阅读教材P26）

1．分解尿素的细菌合成的 将尿素分解成氨，使培养基的 增强。

2．在以 为唯一氮源的培养基中加入 指示剂培养细菌，若指示剂变红，可确定该种细菌能够分解尿素。

【合作探究1】下面是土壤中分解尿素的细菌的分离与计数的实验流程示意图，请结合教材提供的资料分析：

细菌

放线菌

真菌

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2019.4.11 1．实验设计和操作提示

步骤

实验操作

从酸碱度接近 的潮湿土壤中取样。土壤取样

先铲去表层土 ，再取样，将样品装入事先准备好的信封中

制备培养基

分别配制牛肉膏蛋白胨培养基和以 为唯一氮源的 培养基

①称取 g土样加到盛有 mL无菌水的锥形瓶中，充分摇匀

②吸取上清液 mL，转移至盛有 mL样品的稀无菌水的无菌大试管中，按照上图流程进行操作提示

取样用的小铁铲和盛土样的信封都要经过 。

牛肉膏蛋白胨培养基可以作

为 ，用来判断选择培养基是否起到了 作用

①应在 旁称取土样

②由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围 倍的稀释液

③实验时要对所用的平板、试管作好 。如培养皿要注明培养基类型、培养时间、 、培养物等

在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显 选择培养基上的数目，才说明选择培养基有 作用

①如果得到了 菌落数目符合要求的平板，则说明稀释操作比当菌落数目稳定时，选取菌落数在 的平板进行计数。在同一稀释度下，至少

计数

对 个平板进行重复计数，然后求出 ，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目

较成功

②如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明实验不精确，需要 。

③在菌落计数时，每隔24 h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏一些菌落。

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释和涂布

样品的稀释

③按照由10～10稀释度的顺序分别吸

取 mL进行 操作。按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管

将涂布好的培养皿放在 _℃温度下培培养

养。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。比较牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录

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2019.4.11 2．菌落特征：包括菌落的 、大小、隆起程度和 等。

3．菌种的鉴定

挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含 培养基的斜面中，由于细菌合成的 分解尿素产生了氨，使培养基的碱性 ，pH上升，使指示剂变色，菌落周围变 。

【合作探究2】土壤中微生物的分离与计数的重点剖析

(1)样品的稀释和涂布

①观察流程示意图(教材P23图2－7)，在样品稀释时每一次用吸管吸取土壤悬液前，都要吹吸三次后再吸取的目的？

. ②为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？这样做的目的是？

原因： . 目的： 。

③判断样品稀释操作成功的依据？

. (2)选择培养基

①伊红—美蓝只能显示有无大肠杆菌，它是否属于选择培养基？

. ②一种自养微生物与多种异养微生物混合在一起，如何将自养微生物选择出来？

. ③某地发生石油泄漏事件，一些微生物可以有效地分解石油，如何配制选择培养基将这类微生物选择出来？

. (3)分离分解尿素的细菌的实验设计原则

A设立重复组：统计某一稀释度下平板上的菌落数时，每一稀释倍数的菌液都至少要涂布 个平板，作为实验重复，求其 值，若其中有菌落数与其他实验差距悬殊的，需要对该平板重新制作。

B设立两种对照组

①判断培养基中是否有杂菌污染，需将 培养基同时进行培养。

②判断选择培养基是否具有筛选作用，需设立 培养基进行接种后培养，观察两种培养基上 ，进行对比得出结论。

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2019.4.11 (4)分离尿素分解菌操作的注意事项

①在实验操作中，每个步骤都要注意 操作，以防培养基被污染，影响实验效果。

②样品稀释液的最佳浓度为每个平板上有 个菌落，这个稀释度细菌一般为10、10、10倍液，放线菌一般为10、10、10倍液，真菌一般为10、10、10倍液。

③为排除非测试因素(培养基)的干扰，实验需设置 培养基进行空白对照。

【跟踪检测2】广东省是我国甘蔗生产区之一。甘蔗是一种高光效的C4植物，单位面积产量很高，种植面积日益扩大，目前已成为南方地区燃料酒精生产的重要原料。利用甘蔗生产燃料酒精的一般工艺流程为：甘蔗→榨汁(蔗糖)→酵母菌发酵→蒸馏→成品(燃料酒精)。

(1)具有耐高糖和耐酸特性的酵母菌是理想的酒精发酵菌种，对野生酵母菌进行诱变后通过筛选可以得到具有这些特性的突变菌，诱变及筛选过程如下：

步骤1：野生菌液体培养一段时间后接受紫外线照射诱变处理。

步骤2：制备选择培养基。在基本培养基的基础上，注意________和________，加琼脂后灭菌，制成固体平板。

步骤3：将紫外线照射后的菌液稀释涂布平板。

步骤4：根据__________________________________，筛选出突变菌。

(2)上述步骤2、3和4的依据分别是_____________________________________。

(3)在缺乏氮源的培养基上，大部分微生物无法生长；在培养基中加入青霉素可以抑制细菌和放线菌的生长；在培养基中加入10%的酚可以抑制细菌和霉菌的生长。利用上述选择培养基依次能从混杂的微生物群体中分离出(

) A．乳酸菌、金黄色葡萄球菌、放线菌 B．固氮细菌、大肠杆菌、放线菌

C．固氮细菌、霉菌、放线菌 D．固氮细菌、金黄色葡萄球菌、放线菌

(4)用稀释涂布平板法统计样品中活菌的数目。在某稀释浓度下某同学做了若干个平板并统计每个平板的菌落数，最接近样品中菌体数真实值的是(

) A．菌落数量最多的平板 B．菌落数量最少的平板

C．菌落数量适中的平板 D．若干个平板菌落数量的平均值

(5)下列是关于“检测土壤中细菌总数”实验操作的叙述，其中错误的是(

) A．用蒸馏水配制牛肉膏蛋白胨培养基，经高温、高压灭菌后倒平板

B．取10、10、10倍的土壤稀释液和无菌水各0.1 mL，分别涂布于各组平板上

C．将实验组和对照组平板倒置，37 ℃恒温培养24～48小时

D．确定对照组无菌后，选择菌落数在300以上的实验组平板进行计数

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2019.4.11 【知识网络构建】土壤中分解尿素的细菌的分离

(1)分离原理：土壤中的细菌之所以能分解尿素，是因为它们能合成 ，这种物质在把尿素分解成无机物的过程中起到 作用。

(2)统计菌落数目：统计样品中的活菌一般用 法。

【方法技巧】统计菌落数目的两种方法

(1)显微镜直接计数法：

原理

方法

缺点

(2)间接计数法(活菌计数法)：

原理

计算公式

操作

当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌，通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌

每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M，其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)，M代表稀释倍数

设置重复组，增强实验的说服力与准确性。同时为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数

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利用特定细菌计数板或血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积的样品中微生物的数量

用计数板计数

不能区分死菌与活菌

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2019.4.11 【课堂巩固】

1.下表是某同学列出的分离土壤中微生物培养基的配方，据此回答下列问题：

培养基配方

KH2PO4

Na2HPO4

MgSO4·7H2O 葡萄糖

尿素

琼脂

1.4 g 2.1 g 0.2 g 10.0 g 1.0 g 15.0 g 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL

(1)从作用上看，该培养基属于________培养基，提供氮源的物质是________，细菌能利用该氮源是由于体内能合成________酶。

(2)在对分离的能分解尿素的细菌进行鉴定时，还需在培养基中加入________指示剂，若指示剂变________，说明有目的菌株存在。

(3)为了测定微生物的数量，接种时应采用__________________法，某同学在4个培养基上分别接种稀释倍数为10的土壤样液0.1 mL，培养后菌落数分别为180、155、176、129个，则每毫升原土壤样液中上述微生物的数量为________，测定的活菌数比实际活菌数________(填“低”“高”“基本一致”)。

2.(2015·全国Ⅰ，39)已知微生物A可以产生油脂，微生物B可以产生脂肪酶。脂肪酶和油脂可用于生物柴油的生产。回答有关问题：

(1)显微观察时，微生物A菌体中的油脂通常可用______________染色。

(2)为了从自然界中获得能产生脂肪酶的微生物B的单菌落，可从含有油料作物种子腐烂物的土壤中取样，并应选用以________为碳源的固体培养基进行培养。

(3)若要测定培养液中微生物B的菌体数，可在显微镜下用____________________直接计数；若要测定其活菌数量，可选用____________________法进行计数。

(4)为了确定微生物B产生的脂肪酶的最适温度，某同学测得相同时间内，在35 ℃、40 ℃、45 ℃温度下降解10 g油脂所需酶量依次为4 mg、1 mg、6 mg，则上述三个温度中，________ ℃条件下该酶活力最小。为了进一步确定该酶的最适温度，应围绕________ ℃设计后续实验。

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2019.4.11 3.在农业生产研究上，常需要进行微生物的分离和计数。

(1)下表为两种微生物的培养基配方：

A组

KH2PO4

1.4 g B组

纤维素粉

5 g

注：上述两种培养基中的物质溶解后，均用蒸馏水定容至1 000 mL。

①从功能上来看，上述两种培养基均属于____________培养基。

②如果要对土壤中分解尿素的细菌进行分离，则需要选择________培养基(填“A”或“B”)，该培养基中的碳源是________________。

③在分离尿素分解菌所用的培养基中可加入________指示剂，根据指示剂的颜色可鉴定某种细菌能否分解尿素，若有分解尿素的细菌，培养基将会呈现__________。

(2)下图是某同学采用的接种微生物的方法，请回答下列问题：

NaNO3

1 g Na2HPO4·

7H2O 1.2 g KH2PO4

0.9 g MgSO4·

7H2O 0.5 g KCl 0.5 g 酵母膏

0.5 g 水解

酪素

0.5 g Na2HPO4

2.1 g MgSO4·7H2O 0.2 g 葡萄糖

10.0 g 尿素

琼脂

1.0 g 15.0 g

①本实验采用的接种微生物的方法是______________法，把聚集的菌种逐步__________分散到培养基的表面，为达到这一目的，操作上应注意：_____________________(至少答2项)。

②三位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中细菌数量，在对应稀释倍数为10的培养基中，得到以下统计结果：

甲同学涂布了两个平板，统计的菌落数是236和260，取平均值248；

乙同学涂布了三个平板，统计的菌落数是210、240和250，取平均值233；

丙同学涂布了三个平板，统计的菌落数是21、212和256，取平均值163；

在三位同学的统计中，________同学的统计是正确的。

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