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生物技术实践专题复习之基础知识

讲义

【核心知识】

一、微生物的培养与分离

1.培养基制备:计算→称量→溶化→灭菌→倒平板。

2.两种纯化培养方法:

(1)平板划线法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线将聚集的菌种分散开。

(2)稀释涂布平板法:将菌液进行一系列的梯度稀释,然后将不同稀释度的菌液分别涂布在琼脂固体培养基表面,从而能在培养基表面形成单个菌落。

3.微生物的筛选与鉴定:

(1)两种选择培养基。

①以尿素为唯一氮源的培养基:选择培养尿素分解菌。

②富含纤维素的培养基:选择培养纤维素分解菌。

(2)两种鉴别培养基。

①添加酚红指示剂的培养基:尿素分解菌可使该培养基变红。

②添加刚果红的培养基:纤维素分解菌的菌落周围产生透明圈。

4.两种微生物计数的方法:

(1)直接计数法:用血细胞计数板借助显微镜观察计数,不能区分菌种死活,实验结果偏大。

(2)间接计数法:稀释涂布平板法,实验结果偏小。

二、传统发酵技术

1.发酵过程中消毒、灭菌的措施:

(1)果酒和果醋的制作。

①榨汁前葡萄应该先冲洗再去枝梗。②用体积分数为70%的酒精消毒。

(2)腐乳的制作。

①制作腐乳的玻璃瓶要洗刷干净后用沸水消毒。②酒、盐、香辛料都有杀菌作用。

③接种、封瓶时都要进行无菌操作。

2.影响酒精发酵的两大因素:

(1)发酵前期供氧不足。

①结果:酵母菌数量少,产生酒精少。

②原因:前期,酵母菌大量增殖,耗能多,需要通入空气或在发酵瓶中留有一定空间。

(2)发酵后期密封不严。

①结果:酵母菌数量充足,但是产生的酒精较少或不能产生酒精。

②原因:后期要通过密封严格控制无氧环境,以利于酵母菌通过无氧呼吸产生酒精。

三、植物有效成分的提取

1.植物有效成分的三种提取方法:

(1)蒸馏法:适合提取化学性质稳定、易挥发且不与水混溶的物质。

(2)压榨法:适合提取高温易分解或原料易焦糊且含量较高的物质。

(3)萃取法:适合提取易溶于有机溶剂的物质。

2.物质分离的五种方法:

(1)分液法:分离油水混合物。

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(2)过滤法:除去固体物和残渣。

(3)离心法:除去液体中质量较小的固体残留物。

(4)加入无水硫酸钠后过滤:除去芳香油中的残留水分。

(5)蒸馏法:除去萃取液中的有机溶剂。

【特别提示】

1.果酒和果醋的制作时的注意事项

（1）材料的选择与处理：选择新鲜的葡萄，榨汁前先将葡萄冲洗，并除去枝梗，以防葡萄汁流失及污染。冲洗以洗去灰尘为目的，且不要太干净，以防洗去野生型酵母菌。

（2）防止发酵液被污染的方法

①榨汁机要清洗干净并晾干。

②发酵瓶要洗净并用体积分数为70%的酒精消毒，或用洗洁精洗涤。且发酵瓶排气管用曲颈管而不用直管

③清洗葡萄时要先清洗后除枝梗；

④装入葡萄汁后要封闭充气口。

（3）发酵条件的控制

①葡萄汁装入发酵瓶时，要留约1/3的空间，目的是先让酵母菌进行有氧呼吸，快速繁殖，耗尽O2后再进行酒精发酵，防止发酵过程中产生的CO2造成发酵液的溢出；

②严格控制温度：18～25℃利于酵母菌的繁殖和酒精发酵；30～35℃利于醋酸菌的繁殖和果醋的发酵；

③充气：酒精发酵为无氧发酵，需封闭充气口；醋酸发酵为有氧发酵，需经充气口充气。

【易错警示】果酒制作的五点提醒

（1）葡萄酒呈现深红色的原因：红葡萄皮的色素进入发酵液。

（2）冲洗葡萄时不能反复冲洗：防止洗去野生酵母菌，导致菌种流失，不能正常发酵。

（3）葡萄汁装入发酵瓶时，要留有大约1/3的空间：目的是先让酵母菌进行有氧呼吸快速繁殖，耗尽瓶内O2后再进行酒精发酵，防止发酵过程中产生的CO2造成发酵液溢出。

（4）果酒发酵时要适时排气：防止发酵装置爆裂。

（5）检测酒精的原理是：在酸性条件下，重铬酸钾与酒精反应呈现灰绿色。

2.影响腐乳品质的“五大”因素

（1）豆腐含水量的控制：豆腐含水量以70%为宜。

①若含水量过高，豆腐块不易成形。②若含水量过低，则不利于毛霉的生长。

（2）盐的用量：制作时，应逐层加盐，近瓶口处盐铺厚一些，以防止杂菌从瓶口进入。

①盐的浓度过高，会影响口味。

②盐的浓度过低，不足以抑制微生物生长，腐乳易腐败变质。

（3）酒的用量：卤汤中酒的含量控制在12%左右为宜。酒精含量的高低与腐乳后期发酵时间的长短有很大关系。

①酒精含量越高，对蛋白酶的抑制作用也越大，会使腐乳成熟时间延长。

②酒精含量过低，蛋白酶的活性高，加快蛋白质的水解，但杂菌繁殖快，豆腐易腐败变质。

（4）发酵的温度：前期发酵温度应保持在15～18 ℃，利于毛霉生长。

（5）香辛料：具有防腐杀菌的作用，也会影响腐乳的风味和质量。

3．泡菜制作的“两点”提醒

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（1）发酵过程不是乳酸菌单独发酵的结果。

①发酵初期：多种微生物进行有氧呼吸的过程，如酵母菌等，此过程会产生气泡。此阶段是形成无氧环境的过程。

②发酵中期：主要是乳酸菌发酵的过程，其他微生物的生长受到抑制。

③发酵后期：乳酸积累，乳酸菌的生长也受抑制，数量减少。

（2）泡菜发酵时间不是越长越好。

①泡菜的发酵时间长，亚硝酸盐含量低，但是发酵时间过长会产生其他有害物质。

②泡菜发酵时间过长，乳酸含量过高，口味不佳。

4.酶的研究

（1）加酶洗衣粉常用的酶制剂有蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶。其中应用最广泛、效果最明显的酶制剂是碱性蛋白酶和碱性脂肪酶。

（2）碱性蛋白酶能将大分子蛋白质水解为可溶性的氨基酸或小分子的肽，所以蛋白质类纤维织物不能用此种加酶洗衣粉洗涤。

（3）温度、酸碱度和表面活性剂都会影响酶的活性从而影响加酶洗衣粉的洗涤效果。

（4）比较普通洗衣粉和加酶洗衣粉的洗涤效果的实验中，实验变量为洗涤剂，其他因素应保持不变，如布料的种类、大小、颜色、污物的量与种类、水温、水质、水量、洗衣粉的用量、浸泡时间和搅拌时间等。

（5）探究不同温度对加酶洗衣粉洗涤效果的影响的实验中，实验变量为温度，其他因素应保持不变。

（6）酶更适合采用化学结合法和物理吸附法固定化，而细胞多采用包埋法固定化。

（7）制备固定化酵母细胞的基本步骤是：酵母细胞的活化→配制CaCl2溶液→配制海藻酸钠溶液→海藻酸钠与酵母细胞混合→固定化酵母细胞。

（8）配制海藻酸钠溶液要用小火或间断加热。海藻酸钠溶液浓度过高，很难形成凝胶珠；过低，凝胶珠包埋的酵母菌数目少。

（9）固定化酶固定的是一种酶，固定化细胞固定的是一系列酶。

（10）在制备固定化酵母细胞的过程中，溶化好的海藻酸钠溶液要冷却至室温，才能加入已活化的酵母细胞。否则高温会杀死酵母细胞；

（11）固定化酶和固定化细胞技术既实现了对酶的重复利用，降低了成本，又可使酶与产物分离，提高了产品质量。

（12）固定化酵母细胞时，应将海藻酸钠酵母细胞的混合液用注射器缓慢滴加到CaCl2溶液中，而不是注射，以免影响凝胶珠的形成。

5.植物有效成分提取的“三点”提醒

（1）能够利用蒸馏法提取的物质应该具有热稳定性，否则会发生植物有效成分的分解。

（2）不适于蒸馏法的植物芳香油可以用压榨法提取，但是需要原料中植物芳香油的含量较大，否则不易压榨出来。

（3）萃取温度高有利于植物有效成分溶于有机溶剂，但是温度过高会影响植物有效成分的品质，因此萃取时应严格控制温度，适当延长萃取时间。

6.胡萝卜素的鉴定注意问题

（1）层析时注意选择干净的滤纸，为了防止操作时对滤纸的污染，应尽量避免用手直接接触滤纸，可以戴手套进行操作。

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（2）点样时注意应快速细致，点样斑点不能太大（直径应小于0．5cm）。

（3）将点好样的滤纸卷成筒状，卷纸时注意滤纸两边不能相互接触，以免因毛细现象导致溶剂沿滤纸两边的移动加快，溶剂前沿不齐，影响结果。

7.血红蛋白的提取和分离

（1）方法及原理

方法

凝胶色谱法

电泳法

原理

根据相对分子质量的大小分离蛋白质

各种分子带电性质的差异以及分子本身大小、形状的不同

（2）血红蛋白的提取和分离过程

【易错易混】

1.下列有关传统发酵技术的叙述正确的是②③④⑤。

①果酒自然发酵过程中,需人工添加酵母菌种。

②葡萄制作果酒时,若先通入空气再密封发酵,可以增加酒精含量,提高品质。

③腐乳制作过程中加入香辛料既能调制风味,还具有防腐杀菌作用。

④将腐乳胚堆积起来会导致堆内温度升高,影响毛霉生长。

⑤影响泡菜腌制的因素包括时间、温度和食盐的用量等。

2.下列有关微生物的叙述,正确的是①。

①筛选尿素能分解尿素的细菌所利用的培养基中,尿素是唯一的氮源。

②可以用血细胞计数板直接统计来自水中的大肠杆菌。

③高压灭菌锅加热时,打开排气阀使压力表指针回到零后,开启锅盖。

④刚果红可与纤维素形成透明的复合物,所以可通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

3.下列有关植物有效成分提取的叙述,正确的是②③。

①提取玫瑰精油的玫瑰花应该选择在花开的初期采收,因为此阶段的花含油量最高。

②用柑橘皮作为材料提取橘皮精油时不适合用水中蒸馏的方法。

③由于胡萝卜素易溶于石油醚等有机溶剂,所以可以采用萃取法进行提取。

④蒸馏法的实验原理是利用水将芳香油溶解,再把水蒸发掉,剩余的就是芳香油。

⑤油水混合物中加入无水硫酸钠,有利于分离油层。

4.关于传统发酵技术的3个误区

（1）误认为微生物培养基中都需有机碳源、氮源。自养型微生物的培养不需加有机碳源，

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固氮菌的培养不需加氮源。

（2）误认为泡菜制作过程中乳酸和亚硝酸盐的含量都是先增加后减少。泡菜制作过程中乳酸含量是先增加后保持稳定。

（3）误认为果酒、果醋制作过程中都需要无氧条件。果醋制作过程中，利用的是醋酸菌的有氧呼吸，因此需要有氧条件。

5.走出微生物培养的4个误区

（1）平板划线法纯化大肠杆菌时不同阶段灼烧接种环的目的不同

①第一次操作：杀死接种环上原有的微生物。

②每次划线之前：杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下次划线的菌种直接来源于上次划线的末端。

③划线结束后：杀死接种环上残存的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。

（2）稀释涂布平板法统计样品中菌落的数目往往比实际数目“低”。这是因为当两个或多个细胞连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。而显微计数法由于不能区分死菌与活菌，故所得数值可能比实际值“偏高”。

（3）平板划线法只适用于微生物的提纯，不适用于微生物的计数，并且在最后一次划线的末端处的菌种最纯。

（4）倒平板的温度一般在50 ℃左右适宜，温度过高会烫手，温度过低培养基又会凝固。平板冷却凝固后需倒置，这样既可使培养基表面的水分更好地挥发，又防止皿盖上的水珠落入培养基，造成培养基污染。

6.植物有效成分提取应注意的五个关键点

（1）水蒸气蒸馏过程中可用明火加热，萃取过程应该避免明火加热，采取水浴加热，这是因为有机溶剂都是易燃物，直接用明火加热容易引起燃烧、爆炸。

（2）在用水蒸气蒸馏法制取玫瑰精油的过程中，油水混合物中要加入NaCl的目的是增大水的密度，有利于玫瑰精油与水的分层。加入无水Na2SO4的目的是吸收精油中残留的水分。

（3）蒸馏时若温度太高，时间太短，产品品质较差，若提高品质，可适当延长蒸馏时间。

（4）橘皮压榨前，可在石灰水中浸泡10 h以上，既防止压榨时滑脱，提高出油率，又不会在过滤时堵塞筛眼。

（5）萃取时一般来说原料颗粒小，萃取温度高，时间长，则提取的物质能够充分溶解，萃取效果较好。

7.胡萝卜素粗品鉴定过程中的5个易错点

（1）层析时没有选择干净的滤纸，导致实验现象不明显。为了防止操作时对滤纸的污染，应尽量避免用手直接接触滤纸，可以戴手套进行操作。

（2）点样时点样圆点太大(直径大于2 mm)会导致最终在滤纸上形成一条线，无法辨认被提取的色素。点样圆点的直径应为2 mm。

（3）将点好样的滤纸卷成圆筒状，卷纸时不能将滤纸两边相互接触，以避免由于毛细现象导致溶剂沿滤纸两边的移动加快，溶剂前沿不齐，影响结果。

（4）层析液没及样品原点，色素溶解于层析液中，造成实验失败。层析液不可没及样品原点，以免色素溶解于层析液中，使鉴定失败。

（5）没有设置标准样品作对照。层析液中是否提取到胡萝卜素，可通过与标准样品中的β­胡萝卜素作对比予以确认。

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【必背语句】

1.果酒制作需要的微生物是酵母菌，它是一种兼性厌氧型微生物，通过有氧呼吸可以大量增殖，通过无氧呼吸可以产生酒精。

2．红葡萄酒中的红色是由于红葡萄皮中的色素进入发酵液产生的。

3．果醋制作需要的微生物是醋酸菌，它是一种好氧菌，所以果醋制作需要一直通入氧气。

4．果酒和果醋制作需要的温度分别是18～25 ℃和30～35 ℃。

5．腐乳的制作需要多种微生物参与，但主要是毛霉的作用。通过脂肪酶、蛋白酶等酶的作用，将一些大分子物质水解成小分子物质。

6．腐乳的风味主要取决于卤汤和酒的作用。

7．在腐乳制作过程中加入香辛料的作用是既能调节风味，还具有防腐杀菌作用。

8．在腐乳制作过程中，盐的用量要适宜，酒的含量一般控制在12%左右。

9．水蒸气蒸馏法只适用于具有挥发性的，能随水蒸气蒸馏而不被破坏，与水不发生反应，且难溶或不溶于水的成分的提取。

10．压榨橘皮时使用石灰水充分浸泡原料的目的是破坏细胞结构，分解果胶，防止橘皮压榨时滑脱，提高出油率。

11．影响萃取的主要因素是萃取剂的性质和使用量。

12.无菌操作技术包括消毒和灭菌，消毒包括煮沸消毒、巴氏消毒、化学药剂消毒和紫外线消毒等；灭菌包括灼烧灭菌、干热灭菌和高压蒸汽灭菌。

13．培养基的制备包括计算、称量、溶化、灭菌、倒平板等步骤，倒置平板的目的是防止培养皿盖上的水滴滴入培养基造成污染。

14．大肠杆菌的纯化包括平板划线法和稀释涂布平板法。平板划线法要求多次划线，稀释涂布平板法要求菌液要充分地稀释。

15．微生物的计数要求制作多个平板，且每个平板上能长出30～300个菌落。

16．尿素分解菌和纤维素分解菌的分离都运用了选择培养基，前者所用的培养基中尿素是唯一的氮源，后者所用的培养基中纤维素是唯一的碳源。

17.在苹果泥和果胶酶混合之前，一定要保证底物和酶达到所要求的温度或pH条件，以避免混合后条件的变化，确保实验结果的可靠性。

18.同等条件下的酶促反应速率的快慢可以表示酶活性的高低，但酶活性与酶促反应速率仍然是两个完全不同的概念，其影响因素也不完全相同，如酶的浓度、反应物的浓度可以影响酶促反应速率，但不能影响酶的活性。

19.比较普通洗衣粉和加酶洗衣粉的洗涤效果的实验中，实验变量为洗涤剂，设计时应遵循单一变量原则，对照性原则，有效地控制其他变量，如水的用量、污物的量、所用实验用布的质地大小、两种洗衣粉的用量、搅拌及洗涤时间等。

20.探究加酶洗衣粉最适温度的实验中，根据实际生活中的情况，温度梯度可进一步设置为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃，若测出40℃时洗涤效果较好，应设置更细的实验组，如35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃，直至测出具体的最适温度。

21.在使用加酶洗衣粉时不但要考虑最佳洗涤效果的条件，如最适温度、pH，还要考虑衣物的承受能力，如蛋白酶洗衣粉不能洗涤丝绸类衣物；也要考虑洗涤成本问题；因为污渍的成分比较复杂，一般选择复合加酶洗衣粉，以减少用量。

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