课题3　血红蛋白的提取和分离ppt课件教学实录

专题5课题3 血红蛋白的提取和分离

【课题目标】

本课题通过尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，使学生能够体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理，为今后学习运用这些技术打下基础。

【课题重点与难点】

课题重点：凝胶色谱法的原理和方法。

课题难点：样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。

【导学诱思】

一、基础知识

（一）凝胶色谱法[来源:学。科。网Z。X。X。K]

1、凝胶色谱法也称做

，是根据

分离蛋白质的有效方法。

2、凝胶实际上是一些微小的

球体，这些小球体大多数是由

构成的，如葡聚糖或琼脂糖。

3、在小球体内部有许多贯穿的通道，相对分子质量不同的蛋白质分子通过凝胶时速度不同，相对分子质量

的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程

，移动速度

；而相对分子质量

的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在

移动，路程

，移动速度

。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。

（二）缓冲溶液

1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液PH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。

2、作用：能够抵制

的对溶液的

的影响，维持pH基本不变。

3、缓冲溶液的配制

通常由

种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的

就可以制得

使用的缓冲液。

3、生物体内进行的各种生物化学反应都是在一定的pH下进行的，为了

，必须保持体外的pH与体内的

。

思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？

（三）电泳

1、概念：电泳是指

。

2、原理：许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上

。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷

的电极移动。电泳利用了待分离样品中各分子

的差异以及分子本身的

、

的不同，使带电分子产生不同的

，从而实现样品中各种分子的分离。

3、分类：两种常用的电泳方法是

和

。在凝胶中加入SDS（十

1

二烷基硫酸钠），电泳速率完全取决于

，因此，在测定蛋白质分子量时通常使用

。

二、实验操作

蛋白质的提取和分离一般分为四步：

、

、

和

。

（一）样品处理

1、红细胞的洗涤：

①目的：去除

②方法：

离心（速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果），然后用胶头吸管吸出上层透明的

，将下层

的红细胞液体倒入烧杯，再加入

（质量分数为

），缓慢搅拌

min，

离心，如此重复洗涤三次，直至

，表明红细胞已洗涤干净。

2、血红蛋白的释放：加

到

体积，再加40％体积的

（溶解细胞膜），置

上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）, 细胞破裂释放出血红蛋白。

3、分离血红蛋白溶液：将搅拌好的混合溶液离心（2000r/min）后，试管中的溶液分为4层。第一层为无色透明的

，第2层为白色薄层固体，是

，第3层是红色透明液体，这是

，第4层是

的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的

。

（二）粗分离：透析

取1mL的血红蛋白溶液装入

中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量的浓度为20mmol/L的

（pH7.0）中，透析12h。透析可以去除样品中

的杂质，或用于更换样品的缓冲液。[来源:学科网]

（三）纯化：凝胶色谱操作

1、制作凝胶色谱柱

2、装填凝胶色谱柱(固定、计算、溶胀、装填、洗涤平衡) ①装填前将色谱柱

固定在支架上。因为干的凝胶和用缓冲液平衡好的凝胶的体积

，所以装柱前需要根据色谱柱的内体积计算所需要的凝胶量。

②装填时凝胶要

缓慢倒入色谱柱内，装填时要轻轻敲动色谱柱，使凝胶装填

，色谱柱内不得有

存在，一旦发现，必须重装。

③装填完后，

连接缓冲液洗脱瓶，在约50cm高的操作压下，用300mL物质的量浓度为20mmol/L的

（pH7.0）充分洗涤平衡凝胶12h，使凝胶

。

3、样品的加入和洗脱

（1）加样前：打开下端出口，使柱内凝胶面上的

缓慢下降到与

平齐，关闭出口

（2）加透析样品

①调整缓冲液面：与凝胶面平齐

2

②滴加透析样品：用

将1ml

的样品加到色谱柱的

。

③样品渗入凝胶床：

④洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱

⑤收集：待

接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每

收集一管连续收集

思考：与其它真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质的分离有什么意义？

（四）纯度鉴定：

三、实验结果分析与评价

观察血液样品离心后________，如果分层不明显，可能是____________未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使______________一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。

如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带_____、_____、______，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。

【课堂练习】

1.用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质

(

)

A．路程较长，移动速度较慢

B．路程较长，移动速度较快

C．路程较短，移动速度较慢

D．路程较短，移动速度较快

2.蛋白质提取和分离分为哪几步

(

) A．样品处理、凝胶色谱操作、SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳

B．样品处理、凝胶色谱操作、纯化

C．样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定

D．样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定

3. 在血红蛋白的整个提取过程中，不断用磷酸缓冲液处理的目的是

(

) A．磷酸缓冲液会加速血红蛋白的提取过程

B．血红蛋白是一种两性物质，需要酸中和

C．防止血红蛋白被02氧化

D．让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持其结构和功能

4．在盛有红褐色的Fe(OH)3，胶体的U形管的两个管口，各插一个电极，通直流电后，发现阴极附近的颜色逐渐加深，这说明

(

) A．Fe(OH)3胶体粒子带正电荷，向阴极移动

B．Fe(OH)3胶体粒子带负电荷，向阳极移动

C．Fe(OH)3胶体粒子带正电荷，向阳极移动

D．Fe(OH)3胶体粒子带负电荷，向阴极移动

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