课题3　血红蛋白的提取和分离教案2

课题3

血红蛋白的提取和分离

(时间：30分钟

满分：50分) 考查知识点及角度

血红蛋白提取与分离原理

血红蛋白提取与分离操作

样品处理及结果分析

一、选择题(每小题4分，共20分) 1．利用凝胶色谱法先洗脱出来的蛋白质是

(

)。

A．相对分子质量大的

B．溶解度高的

C．相对分子质量小的

D．所带电荷多的

解析

相对分子质量较小的蛋白质能进入凝胶内部通道，路程较长，移动速度较慢；相对分子质量大的蛋白质，路程较短，移动速度较快，首先洗脱出来。

答案

A 2．将经处理破裂后的红细胞混合液以2 000 r/min的速度离心10 min后，离心管中的溶液分为四层，从上到下的顺序依次是

(

)。

A．血红蛋白、甲苯层、脂溶性物质层、沉淀层

B．甲苯层、沉淀层、血红蛋白、脂溶性物质层

C．脂溶性物质层、血红蛋白、甲苯层、沉淀层

D．甲苯层、脂溶性物质层、血红蛋白、沉淀层

解析

混合液经离心后，按密度大小排列，在离心管中从上到下的顺序依次是：第1层为无色透明的甲苯层；第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质沉淀层；第3层为红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液；第4层为暗红色沉淀物，主要是红细胞破碎物沉淀。

难度及题号

基础

1、3、5 6 2、4 中档

7

稍难

8

答案

D 3．下列关于电泳的说法不正确的是

(

)。

A．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程

B．带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动

C．蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少

D．用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电泳迁移率完全取决于分子的大小

解析

蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素，SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差异，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。

答案

C 4．已知某样品中存在甲、乙、丙、丁、戊五种物质，其分子大小、电荷的性质和数量情况如下图所示。下列叙述正确的是

(

)。

A．将样品装入透析袋中透析12 h，若分子乙保留在袋内，则分子甲也保留在袋内

B．若五种物质为蛋白质，则用凝胶色谱柱分离时，甲的移动速度最快

C．将样品以2 000 r/min的速度离心10 min，若分子戊存在于沉淀中，则分子丙也存在于沉淀中

D．若五种物质为蛋白质，用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品中的蛋白质分子，则分子甲和分子戊形成的电泳带相距最近

解析

透析的原理是相对分子质量小的物质能透过半透膜，相对分子质量大的物质不能透过，乙保留在袋内，甲则不一定保留在袋内；凝胶色谱柱分离

时，相对分子质量小的物质路程长、移动慢；离心时相对分子质量大的物质先沉淀，戊沉淀，则乙、丁、丙均已沉淀；用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质时，电泳迁移率主要取决于分子大小。

答案

C 5．下面说法不正确的是

(

)。

A．在一定范围内，缓冲溶液能够抵制外界的酸、碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变

B．缓冲溶液通常由1～2种缓冲剂溶解于水中配制而成

C．电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程

D．透析袋能使大分子自由进出，而将小分子保留在袋内

解析

透析袋一般是用硝酸纤维素(又叫玻璃纸)制成的。透析袋能使小分子自由进出，而将大分子保留在袋内。透析可以除去样品中相对分子质量较小的杂质。

答案

D 二、非选择题(共30分) 6．(10分)血红蛋白是人和其他脊椎动物红细胞的主要组成成分，负责血液中O2或CO2的运输。请根据血红蛋白的提取和分离流程图回答问题。

(1)将实验流程补充完整：A为________，B为________。凝胶色谱法是根据______________________而达到蛋白质分离的有效方法。

(2)洗涤红细胞的目的是去除________，洗涤次数过少，无法除去________；离心速度过高和时间过长会使________一同沉淀，达不到分离的效果。洗涤干净的标志是__________。释放血红蛋白的过程中起作用的是__________。

(3)在洗脱过程中加入物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液(pH为7.0)的

目的是__________________。如果红色区带__________，说明色谱柱制作成功。

解析

凝胶色谱法是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法，在蛋白质分离与提取过程中包括样品的处理、粗分离、纯化和纯度鉴定四步，每一步均应用了不同的操作技术，需要注意。

答案

(1)血红蛋白的释放

样品的加入和洗脱

相对分子质量的大小

(2)杂蛋白(血浆蛋白)

血浆蛋白

白细胞和淋巴细胞

离心后的上清液中没有黄色

蒸馏水和甲苯

(3)准确模拟生物体内的生理环境，保持体外的pH和体内一致

均匀一致地移动

7．(8分)蛋白质分子中，氨基酸的α­氨基和α­羧基虽然大部分结合成为肽键，但是蛋白质分子内仍含有各种酸性基团和碱性基团，如肽链末端的α­氨基和α­羧基、天冬氨酸和谷氨酸残基中的羟基、赖氨酸和组氨酸残基中的各种碱性基团，所以蛋白质是两性电解质。在酸性溶液中，碱性基团的解离增大，使蛋白质带正电荷；在碱性溶液中，酸性基团的解离加强，使蛋白质带负电荷。当溶液到达某一pH时，蛋白质可因内部酸性和碱性基团的解离相等而呈等电状态，这时的溶液pH叫做蛋白质的等电点。不处于等电点状态的蛋白质分子的正、负电荷量是不相同的。试回答下列问题。

(1)多数蛋白质的等电点近于5，一般含碱性基团较多的蛋白质的等电点________(填“偏高”或“偏低”)。

(2)根据等电点的不同，你能用________方法将不同种类的蛋白质分子分开。

(3)简述根据等电点分离不同种类的蛋白质分子的原理。

解析

本题深入到蛋白质内部，从蛋白质分子带电性质及数量的角度，引导学生理解电泳法分离蛋白质的原理。含碱性基团较多的蛋白质溶液，在pH近于5时解离程度较大，蛋白质带正电荷。要使蛋白质内部酸性和碱性基团解离相等呈等电状态，必须提高溶液的pH，使酸性基团解离增加，故蛋白质的等电点提高。根据等电点不同，可以利用电泳法将特定的蛋白质分离出来。

答案

(1)偏高

(2)电泳

(3)调节电泳槽中缓冲液的pH，使某种蛋白质处于等电点状态，而其他蛋白质带有电荷，在电场作用下，带有正、负电荷的蛋白质分别移向两极，而不

带电荷的蛋白质留在原处。

8．(12分)凝胶色谱技术是六十年代初发展起来的一种快速而又简单的分离技术，由于设备简单、操作方便，不需要有机溶剂，对高分子物质有很高的分离效果，目前已经被生物化学、分子生物学、生物工程学、分子免疫学以及医学等有关领域广泛应用，不但应用于科学实验研究，而且已经大规模地用于工业生产。据图回答下面的问题。

(1)a、b均为蛋白质分子，其中先从层析柱中洗脱出来的是______，原因是________________________。

(2)自己制作凝胶色谱柱时，在色谱柱底部d位置相当于多孔板的结构可由________替代。

(3)装填凝胶色谱柱时，色谱柱内不能有气泡存在，原因是________________________。

(4)洗脱用的液体应尽量与浸泡凝胶所用的液体______(填“相同”或“不同”)，洗脱时，对洗脱液的流速要求是________。

解析

用凝胶色谱法分离各种大分子物质时，大分子物质先洗脱出来，然后是小分子物质。大分子物质由于直径较大，不易进入凝胶颗粒的微孔，而只能分布于颗粒之间，所以向下移动的速度较快。小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外，还可以进入凝胶颗粒的微孔中，即进入凝胶内，在向下移动的过程中，从一个凝胶颗粒内扩散到颗粒间隙后再进入另一凝胶颗粒，如此不断地进入和扩散，小分子物质的下移速度落后于大分子物质从而落后于大分子物质洗脱出来。在色谱柱中装填凝胶的时候要尽量紧密，以减少凝胶颗粒之间的空隙。在装填凝胶色谱柱时，不得有气泡存在，因为气泡会搅乱

洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果；凝胶色谱操作过程中，不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。一旦发生上述两种情况，凝胶色谱柱需要重新装填。

答案

(1)a

a的相对分子质量大，无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快

(2)尼龙网和尼龙纱

(3)气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果(4)相同

保持稳定