课题3　分解纤维素的微生物的分离教学设计与反思

课题3 分解纤维素的微生物的分离

一、基础知识

（一）纤维素与纤维素酶：

1、纤维素的化学组成：

C、H、O

三种元素，是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是地球上含量最丰富的多糖类物质。纤维素能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。

问题：草食性动物是怎样消化食物中纤维素的？

答：肠胃中的共生微生物。

2、纤维素的分布：棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物，此外，木材、作物秸秆等也富含纤维素。

3、纤维素酶的作用：纤维素酶是一种

复合酶

，一般认为它至少包括三种组分，即C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。过程如下：

（1）纤维素酶实验中对照的构成：

在一支试管中添加纤维素酶，另一支试管不添加纤维素酶；尽管醋酸－醋酸钠缓冲液用量不同，但都能维持相同的pH。

（2）1个酶活力单位：指在温度为

25 ℃，其它反应条件最适宜情况下，在

1 min内转化

1mmol 的底物所需要的酶量。

（二）纤维素分解菌的筛选：

1、筛选方法：刚果红染色法。该方法可以通过颜色反应直接筛选。

2．筛选原理：刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，红色复合物无法形成，出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，我们可以通过

是否产生透明圈

来筛选纤维素分解菌。

二、实验设计：

1、实验方案流程图：

土壤取样

选择培养

纯化培养

梯度稀释

涂布到鉴别纤维素分解菌培养基上

微生物培养

纤维素

C1酶、Cx酶

纤维二糖

葡萄糖苷酶

葡萄糖

挑选产生透明圈的菌落

2、土壤取样：

（1）纤维素分解菌大多分布在富含纤维素的环境中。

（2）为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？

生物适应一定环境，环境对生物具有选择作用，只有在纤维素含量丰富的环境中纤维素分解菌的含量才会高于其它普通环境，从而提高获得目的微生物的几率。

（3）将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋进土壤多深？

人工设置适宜环境，使纤维素分解菌相对聚集。将纸埋于深约10cm的腐殖土壤中。

3、选择培养：

（1）选择培养的目的：增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物。

问题：为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？

在选择培养条件下，可使能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。

（2）选择培养基：属于液体选择培养基，原因是没有添加琼脂成分。

（3）培养基选择作用机制是以纤维素粉为唯一碳源，只有纤维素分解菌才能生存。

（4）选择培养：称取土样20 g，在无菌条件下加入装有30mL培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下振荡培养1～2 d，直至培养液变

混浊

。重复选择培养。

（5）梯度稀释：

依次将培养液稀释101～107倍。思考是如何操作的？

（6）将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上。

（7）若设置一个对照实验说明选择培养的作用，应控制的变量是将纤维素粉改为葡萄糖。

4、刚果红染色法：

（1）刚果红是一种

染料

，它可以与纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。

（2）原理：刚果红可以与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，红色复合物无法形成，出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

（3）染色方法：常用的刚果红染色法有两种。即一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应；另一种是在倒平板时就加入刚果红。

（4）比较两种染色法的各自的优缺点：

方法一是传统的方法，缺点是操作繁琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发生混杂；其优点是这样显示出的颜色反应基本上纤维素分解菌的作用。

方法二的优点是操作简便，不存在菌落混杂的问题，缺点一是由于纤维素和琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应。但这种只产生淀粉酶的微生物产生的透明圈较为模糊，因为培养基中纤维素占主要地位，因此可以与纤维素酶产生的透明圈相区分。缺点二是有些微生物具有降解色素的能力，它们在长时间培养过程中会降解刚果红形成明显的透明圈，与纤维素分解菌不易区分。

染色法

方法一

优点

颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用

缺点

操作繁琐，刚果红会使菌落之间发生混杂

方法二

操作简便，不存在菌落混杂问产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈，有题

些微生物能降解色素，形成明显的透明圈。

5、本实验流程与尿素分解菌的分离实验流程的异同：

尿素分解菌的分离实验流程是将土样制成的菌悬液直接涂布在选择培养基上；本课题通过选择培养使细菌增殖后，再涂布在鉴别培养基上。其它操作基本基本共同。

三、结果分析与评价：

四、课题延伸：

1、为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶实验，纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵。

2、纤维素酶测定方法：对纤维素酶分解滤纸等纤维素所产生的葡萄糖含量进行定量测定。

3、在做纤维素酶分解纤维素的实验过程中，如果没有摇床，可以采用定时人为摇晃锥形瓶的方法代替。