课题2　土壤中分解尿素的细菌的分离与计数优质课教案整理

第6课时

土壤中分解尿素的细菌的分离与计数

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1.通过分析具体培养基的配方，归纳选择培养基的选择作用，理解筛选微生物的原理。2.结合实验设计，分析微生物数量测定实验中产生偏差的原因及解决措施，学会微生物的计数方法，并对培养结果进行分析和评价。

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1.研究培养基对微生物的选择作用，进行微生物数量的测定。2.能利用选择培养基分离细菌，运用相关技术解决生产生活中有关微生物的计数问题。

一、研究培养基对微生物的选择作用

1．筛选菌株

(1)自然界中目的菌株的筛选

①原理：根据目的菌株对__________的要求，到相应的环境中去寻找。

②实例：能产生耐高温的Taq DNA聚合酶的________就是从热泉中筛选出来的。

(2)实验室中目的菌株的筛选

①原理：人为提供有利于_______生长的条件(包括营养、温度、pH等)，同时________其他微生物生长。

②实例：从土壤中筛选能分解尿素的细菌。

③方法：利用______培养基进行微生物的筛选。

2．选择培养基

(1)概念：允许__________种类的微生物生长，同时__________其他种类微生物生长的培养基。

(2)举例：筛选土壤中分解尿素的细菌的选择培养基是以________________为唯一氮源，按物理性质归类为固体培养基。

1．筛选分解尿素的细菌的选择培养基

下面是本课题使用的培养基的配方，请分析：

KH2PO4

Na2HPO4

MgSO4·7H2O 葡萄糖

尿素

琼脂

1.4 g 2.1 g 0.2 g 10.0 g 1.0 g 15.0 g

将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL

(1)在培养基的配方中，为微生物的生长提供碳源和氮源的分别是什么物质？

(2)分离分解尿素的细菌的选择培养基是如何进行选择的？

(3)为什么只有能分解尿素的微生物才能在该培养基上生长？

2．设计对照实验

(1)如何设计对照实验验证该选择培养基的确筛选到了能分解尿素的细菌？

(2)如何设计对照实验验证所用的选择培养基没有受到污染？

归纳总结

选择培养基的分类

1利用营养缺陷型选择培养基进行的选择培养：通过控制培养基的营养成分，使营养缺陷型微生物不能正常生长。

2利用化学物质进行的选择培养：在完全培养基中加入某些化学物质，利用加入的化学物质抑制某些微生物的生长，同时选择所需的微生物。

3利用培养条件进行的选择培养：改变微生物的培养条件如高温、特殊pH等，筛选特定微生物。

1．下列有关微生物筛选的叙述中，不正确的是(

) A．用全营养牛肉膏蛋白胨培养基筛选大肠杆菌

B．用高NaCl的培养基筛选抗盐突变菌株

C．含酚红的尿素培养基筛选鉴别出分解尿素的菌株

D．利用高温条件筛选耐热的Taq细菌

2．下表是微生物培养基的成分。下列有关说法错误的是(

) 编号

成分

含量/g

A.此培养基可用来培养自养型微生物

B．此表中的营养成分共有三类，即水、无机盐、氮源

C．若除去①，此培养基可培养圆褐固氮菌

D．培养基中若加入氨基酸，则它可充当碳源、氮源和生长因子

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选择培养基的常见类型

(1)分离微生物所用的选择培养基一定是固体培养基，因为菌落只能在固体培养基上形成。

(2)常见的选择培养基

①加入青霉素可以分离出酵母菌和霉菌。

②加入高浓度的食盐可得到金黄色葡萄球菌。

③无氮源培养基可以分离固氮微生物。

④以石油为唯一碳源的培养基，可以分离能消除石油污染的微生物。

⑤将培养基放在高温环境中培养，可以分离耐高温的微生物。

二、进行微生物数量的测定

①

(NH4)2SO4

0.4 ②

KH2PO4

4.0 ③

FeSO4

0.5 ④

CaCl2

0.5 ⑤

H2O 100 mL

1．统计菌落数目

(1)方法：__________________________。

(2)统计依据：当样品的______足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个______。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。

(3)操作

①设置重复组，增强实验的说服力与准确性。

②为保证结果准确，一般选择菌落数在______的平板进行计数。

③统计的菌落数往往比活菌实际数目______。

(4)计算公式：每克样品中的菌株数＝(C÷V)×M，其中C代表某一稀释度下平板上生长的

________，V代表涂布平板时所用的____________，M代表__________。

2．设置对照

(1)对照实验：是指除了__________以外，其他条件都相同的实验。

(2)主要目的：排除实验组中__________对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。例如，为了确认培养基是否被杂菌污染，需以不进行接种的培养基培养作为空白对照。

3．实验操作流程

(1)土壤取样

①取样原因：土壤有“微生物的____________”之称，同其他生物环境相比，土壤中的微生物数量__________，种类________。

②土壤要求：富含____________，pH接近____________且潮湿。

③取样部位：距地表约______的土壤层。

(2)样品稀释

①稀释原因：样品的__________直接影响平板上生长的____________。

②稀释标准：选用一定稀释范围的样品液进行培养，以保证获得菌落数在________之间，便于计数。

(3)微生物的培养与观察

①培养：根据不同微生物的需要，控制适宜的培养______和培养时间。

②观察

a．观察方法：每隔24 h统计一次菌落数目，最后选取菌落数目稳定时的记录作为结果。

b．菌落的特征：包括菌落的________、______、隆起程度和______等。

(4)菌种鉴定

①原理：细菌合成的______将尿素分解成氨，使培养基的______增强。

②方法：以尿素为唯一氮源的培养基中加入______指示剂，培养某种细菌后，若指示剂变______，可初步鉴定该种细菌能够分解尿素。

4．操作提示

(1)无菌操作

①取土样的用具在使用前都需要______。

②实验操作均应在______进行。

(2)做好标记：本实验使用的平板和试管比较多，为避免混淆，使用前应标明培养基的______、________以及平板上培养样品的______等。

(3)制定计划：对于耗时较长的生物实验，要事先制定计划，以便提高__________。

下面是土壤中尿素分解菌的分离与计数的实验流程示意图，请结合教材提供的资料分析回答

下列问题。

1．试写出分离土壤中分解尿素的细菌的实验流程

2．统计菌落数目

甲、乙两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果。

(1)甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230，该同学的统计结果是否真实可靠？为什么？

(2)乙同学在该浓度下涂布了3个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学将21舍去，然后取平均值。该同学对实验结果的处理是否合理？为什么？

(3)某同学在三种稀释度下吸取0.1 mL的菌液涂布平板，统计菌落数，得到以下的数据，试计算1 g样品的活菌数。

平板

稀释度

104

平板1 320 平板2 360 平板3 356

105

106

212 21 234 23 287 18 (4)为什么统计的菌落数比活菌的实际数目低？

3．对照实验设计的分析

分析教材P22“设置对照”中的实例，探讨下列问题：

(1)在A同学确定自己操作无误的情况下，A同学得出的菌落数多于其他同学的原因可能有哪两种？

(2)如何设计对照实验帮助A同学排除上述两个可能影响实验结果的因素？

4．微生物数量测定的实验设计

(1)为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？

(2)本实验中应如何统计培养基上生长的菌落数？

(3)实验中的无菌操作主要有哪些？

归纳总结

分离尿素分解菌操作中的注意事项

1在实验操作中，每个步骤都要注意无菌操作，以防培养基被污染，影响实验效果。

2样品稀释液的最佳浓度为获得每个平板上有30～300个菌落，这个稀释度细菌一般为104、105、106倍稀释液，放线菌一般为103、104、105倍稀释液，真菌一般为102、103、104倍稀释液。

3为排除非测试因素培养基的干扰，实验需设置牛肉膏蛋白胨培养基进行空白对照。

4每一稀释倍数的菌液都至少要涂布3个平板，作为重复实验，求其平均值，若其中有菌落数与其他平板悬殊过大的，需要对该平板重新制作。

3．如图为“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”实验中样品稀释示意图。据图分析下列叙述正确的是(

)

A．4号试管中稀释液进行平板培养得到的菌落平均数一定恰为5号的10倍

B．5号试管的结果表明每克该土壤中的菌株数目为1.7×108个

C．在用移液管吸取菌液进行梯度稀释时，可用手指轻压移液管上的橡皮头，吹吸三次，使菌液与无菌水充分混匀

D．某一稀释度下至少涂3个平板，该实验方法统计得到的结果常会比实际活菌数目高

4．自然界中的微生物往往是混杂生长的。人们在研究微生物时一般要将它们分离提纯，然后进行数量的测定。下面是对大肠杆菌进行数量测定的实验，请回答有关问题。

(1)实验步骤

①制备稀释倍数为102、103、104、105、106的系列稀释液。

②为了得到更加准确的结果，应选用________________法接种样品。

③适宜温度下培养。

(2)结果分析

①测定大肠杆菌数目时，在对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下几种统计结果，与事实更加接近的是__________。

A．一个平板，统计的菌落数是230 B．两个平板，统计的菌落数是220和260，取平均值240

C．三个平板，统计的菌落数分别是400、212和256，取平均值289 D．四个平板，统计的菌落数分别是210、260、240和250，取平均值240 ②一同学在稀释倍数为106的培养基上测得平板上菌落数的平均值为212，那么每毫升样品中的菌落数约是(涂布平板时所用的稀释液体积为0.2 mL)__________。

③用这种方法测定菌体密度时，实际活菌数量要比测得的数量__________(填“多”或“少”)，因为_____________________________________________________________。

问题导析

(1)因为题中操作的目的是对大肠杆菌进行数量的测定，所以接种的方法是__________________。

(2)测定活菌数量时，选择的平板越多误差______，且选择的平板要能形成______个菌落。

(3)所做的多个平板中，如果其中一个平板中菌落的数目明显____________其他几个平板，则说明该平板不符合要求，应______或舍弃。

一题多变

(1)如果某同学的稀释倍数仅为104，则测定的数值要比题中测定的数值高还是低？为什么？

________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。

(2)第(2)问第①小题C项中菌落数为400的平板不符合要求，试分析该平板中菌落数目多于其他平板的可能的原因。

________________________________________________________________________ ________________________________________________________________________。

技巧链接

用稀释涂布平板法计数微生物的方法

(1)稀释涂布平板操作要求：按照平行重复的原则，每一稀释度的菌液涂布3个或3个以上的平板。

(2)计数的时机：当各平板上菌落数目稳定时进行计数。

(3)选择可用于计数的平板：选择菌落数在30～300之间的平板(相同稀释度的平板均符合该特点)进行计数，然后取平均值。

1．选择培养基是根据某一种或某一类微生物的特殊营养要求或对一些物理、化学抗性而设计的培养基。利用这种培养基可以将所需要的微生物从混杂的微生物中分离出来。为选择酵母菌和硝化细菌，应选用的培养基分别为(

) A．伊红美蓝培养基、含青霉素的培养基

B．含青霉素的培养基、含氨的无机培养基

C．含氨的无机培养基、含青霉素的培养基

D．含青霉素的培养基、伊红美蓝培养基

2．下列操作步骤顺序正确的是(

) ①土壤取样

②称取10 g土样，加入盛有90 mL无菌水的锥形瓶中

③吸取0.1 mL土壤溶液进行平板涂布

④依次稀释至101、102、103、104、105、106、107稀释度

A．①→②→③→④

C．①→②→④→③

B．①→③→②→④

D．①→④→②→③

3．在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂的目的是(

) A．筛选出能分解尿素的细菌

B．对分离的菌种作进一步鉴定

C．作细菌的营养成分

D．如指示剂变蓝就能准确地认定该菌能分解尿素

4．从土壤中分离以尿素为氮源的细菌，下列实验操作不正确的是(

) A．将土壤用无菌水稀释，制备103～106倍的土壤稀释液

B．将不同浓度的土壤稀释液涂布于不同平板上

C．用加入刚果红指示剂的选择培养基筛选分解尿素的细菌

D．从周围出现红色环带的菌落中挑取能够分泌脲酶的菌株

5．尿素是一种重要的农业肥料，但若不经细菌的分解，就不能更好地被植物利用。生活在土壤中的微生物种类和数量繁多，同学们试图探究土壤中微生物对尿素是否有分解作用，设计了以下实验，并成功筛选到能高效降解尿素的细菌(目的菌)。培养基成分如下表所示，实验步骤如图所示。请分析回答下列问题：

KH2PO4

1.4 g

将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL。

Na2HPO4

2.1 g MgSO4·7H2O 0.2 g 葡萄糖

10.0 g 尿素

1.0 g 琼脂

15.0 g

(1)此培养基________(填“能”或“不能”)用于植物组织培养，理由是____________ ________________________________________________________________________。

(2)培养基中加入尿素的目的是_________________，这种培养基属于________培养基。

(3)“目的菌”生长所需的氮源和碳源分别来自培养基中的__________和__________，实验需要振荡培养，原因是__________________________________________。

(4)图中将细菌转到固体培养基上时，可采用______________或__________________在含尿素的培养基上接种，获得单菌落后继续筛选。初步筛选出来的菌种还需要用生化的方法作进一步的鉴定：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入________指示剂，接种并培养初步筛选的菌种，若指示剂变成________色，则可准确说明该菌种能够分解尿素。

(5)在实验中，下列材料或用具需要灭菌的是________，需要消毒的是________。(填序号) ①培养细菌用的培养基与培养皿

②玻棒、试管、锥形瓶和吸管

③实验操作者的双手

(6)实验结束后，使用过的培养基应该进行________处理后，才能倒掉。

答案精析

一、基础梳理

1．(1)①生存环境

②Taq细菌

(2)①目的菌株

抑制或阻止

③选择

2．(1)特定

抑制或阻止

(2)尿素

问题探究

1．(1)碳源是葡萄糖，氮源是尿素。

(2)该选择培养基的配方中，尿素是培养基中的唯一氮源，因此，只有能够利用尿素的微生物才能够生长。

(3)分解尿素的微生物能合成脲酶，而脲酶可将尿素分解成氨，从而为微生物提供氮源。

2．(1)增设牛肉膏蛋白胨基础培养基并进行涂布平板操作，如果牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落数明显多于选择培养基上的菌落数，则说明选择培养基的确起到了筛选能分解尿素的细菌的作用。

(2)设置一个未涂布平板的能筛选分解尿素的细菌的选择培养基。

拓展应用

1．A

[全营养牛肉膏蛋白胨培养基常用于大肠杆菌的培养，该培养基对微生物无选择作用，A项错误。抗盐突变菌株具有耐高盐的能力，因此可以利用高NaCl的选择培养基进行选择培养，B项正确。分解尿素的菌株会分解尿素形成氨，使培养基pH升高，因此可以利用含酚红的尿素培养基筛选鉴别出分解尿素的菌株，C项正确。利用高温条件可以筛选耐热的Taq细菌，D项正确。]

2．C

[由题知，该培养基成分中含有水、无机盐、氮源，但不含含碳有机物，可用来培养自养型微生物，选项A、B均对；圆褐固氮菌同化类型为异养型，培养基中必须存在含碳有机物，所以该培养基不能用来培养圆褐固氮菌，C错。

]

二、基础梳理

1．(1)活菌计数法、显微镜直接计数法

(2)稀释度

活菌

(3)②30～300

③低

(4)平均菌落数

稀释液的体积(mL)

稀释倍数

2．(1)被测试条件

(2)非测试因素

3．(1)①天然培养基

最大

最多

②有机质

中性

③3～8 cm (2)①稀释程度

菌落数目

②30～300

(3)①温度

②b.形状

大小

颜色

(4)①脲酶

碱性

②酚红

红

4．(1)①灭菌

②火焰旁

(2)种类

培养日期

稀释度

(3)工作效率

问题探究

1．土壤取样→样品稀释→取样涂布→微生物培养→观察并记录结果→细菌计数。

2．(1)不真实。为增加实验的说服力与准确性，应设置重复实验，在同一稀释度下涂布3个平板，统计结果后计算平均值。

(2)不合理。微生物计数时，如果实验中出现重复实验的结果不一致的情况，应分析实验过程中可能的影响因素，找出差异的原因，而不能简单地舍弃后进行计数。

(3)105的稀释度下取0.1 mL涂布的三个平板上的菌落数在30～300之间，计算其平均值为(212＋234＋287)/3≈244。进一步可以换算出1 g样品中活菌数为(244÷0.1)×105＝2.44×108。

(4)当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。

3．(1)可能是他选择的土壤样品不同于其他同学；也可能是培养基受到了污染或操作失误。

(2)①其他同学用与A同学一样的土样进行实验，如果结果与A同学一致，则证明A同学操作无误；如果结果不同，证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题；②将A同学配制的培养基在不加土样的情况下培养作为空白对照，以判断培养基是否受到污染。

4．(1)土壤中各种微生物的数量是不同的，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离。

(2)每隔24 h统计一次菌落数目，选取菌落数目稳定时的记录作为结果。

(3)①培养基、锥形瓶、试管、铲子、信封等，需要进行灭菌。②称取土壤要在火焰旁进行。③稀释土壤溶液的每一步操作都要在火焰旁进行。

拓展应用

3．C 4．(1)②稀释涂布平板

(2)①D

②1.06×109个

③多

当两个或多个细菌连在一起时，平板上观察到的只是一个菌落

解析

(1)若对大肠杆菌进行计数，则需要用稀释涂布平板法接种样品。(2)①应选取多个菌落数相差不大的平板进行计数，取其平均值。②212÷0.2×106＝1.06×109(个)。③因为一个菌落可能由两个或多个细菌连在一起生长而成，所以实际活菌数量要比测得的数量多。

问题导析

(1)稀释涂布平板法

(2)越小

30～300

(3)多于或少于

重做

一题多变

(1)低。因为稀释倍数太低，则大部分菌落是由多个细菌繁殖而成，所以测定的菌落的数值要偏低。

(2)①培养基被污染，一些菌落是由杂菌繁殖而成的；②接种过程中由于操作不当感染了杂菌；③取菌液时没有摇晃，导致所取菌液中细菌个体浓度偏大等。

课堂小结

目的菌株

稀释涂布平板法

显微镜直接计数法

当堂检测

1．B

[酵母菌是真菌，通常可以用含青霉素的培养基进行选择培养，因为青霉素能够抑制细菌生长，但不能够抑制真菌生长。硝化细菌为自养型生物，能够利用氨转变为亚硝酸和硝酸所释放的能量把无机物转变为有机物以维持自身生命活动，利用含氨的无机培养基可进行选择培养。]

2．C 3．B

[筛选出能分解尿素的细菌用选择培养基即可，不需要加指示剂。加入指示剂的培养基，目的是对要分离的菌种作进一步的鉴定。]

4．C

[用加入酚红指示剂的鉴别培养基可以鉴别分解尿素的细菌。]

5．(1)不能

缺少植物激素(或缺少植物需要的一些营养成分)

(2)筛选目的菌

选择

(3)尿素

葡萄糖

为目的菌提供氧气

(4)平板划线法

稀释涂布平板法

酚红

红

(5)①②

③

(6)灭菌

解析

(1)植物组织培养的培养基中需要含有氮、磷、钾及锌、铜、钼、铁等元素，需要蔗糖为植物细胞提供能量，还需要细胞分裂素和生长素等植物激素。(2)该培养基中尿素是唯一的氮源，只有能利用尿素的微生物才能生长，属于选择培养基。(3)“目的菌”生长所需的氮源和碳源分别来自培养基中的尿素和葡萄糖，分解尿素的微生物是需氧型微生物，所以在培养过程中需振荡。(4)在以尿素为唯一氮源的培养基中加入酚红指示剂，培养利用尿素的细菌后，如果pH升高，指示剂将变红，由此可准确地鉴定该种细菌能够分解尿素。(5)微生物培养时，一切环境、物质、用具、器材都要消毒或灭菌。(6)为避免实验后培养基中的微生物污染环境，使用过的培养基必须经过灭菌处理后才能丢弃。