课题3　分解纤维素的微生物的分离国家获奖教案

第7课时

分解纤维素的微生物的分离

[教学目标]

1.结合教材P27“基础知识”，掌握纤维素酶的种类和作用及纤维素分解菌的筛选方法。2.阅读教材P28“实验设计”，理解并掌握纤维素分解菌的筛选过程及刚果红染色法的原理。3.阅读教材P30“课题延伸”，掌握纤维素酶的测定方法。

[重难点击]

1.简述纤维素酶的种类及作用。2.掌握从土壤中分离某种特定微生物的操作技术。3.分析分离分解纤维素的微生物的实验流程，弄懂实验操作的原理。

一

纤维素分解菌的筛选的原理

1.纤维素与纤维素酶

(1)纤维素

据图，纤维素是一种由葡萄糖首尾相连而成的高分子化合物，是地球上含量最丰富的多糖类物质。棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物。纤维素能被土壤中某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。

(2)纤维素酶

①组成：一种复合酶，它至少包括三种组分，即C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶。

②作用

纤维素―――――→纤维二糖―――――→葡萄糖

(3)实验验证

试管

滤纸条

缓冲溶液

pH＝4.8的0.1 mol/L1 1×6 cm 醋酸—醋酸钠缓冲溶液10 mL 1 mL 纤维素酶

(70～80 U/mL) 条件

两试管固定在50 mL锥形瓶中，在摇结果

时间足够长，滤纸被完全分解

C1酶、CX酶葡萄糖苷酶

pH＝4.8的0.1 mol/L2 1×6 cm 醋酸—醋酸钠缓冲溶液11 mL

床上以140 r/min的转速振荡反应1 h 基本无变化

①1个酶活力单位是指在温度为25 ℃，其他反应条件最适宜情况下，在1 min内转化1_mmol的底物所需要的酶量。

②实验是如何构成对照的？

答案

在一支试管中添加纤维素酶，另一支试管不添加纤维素酶；尽管醋酸—醋酸钠缓冲液用量不同，但都能维持相同的pH。

2.纤维素分解菌的筛选

(1)方法：刚果红染色法。常用的有两种方法，一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应；另一种是在倒平板时就加入刚果红。

(2)原理：刚果红＋纤维素→红色复合物――――→纤维素被分解，出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。

归纳提炼

两种刚果红染色法的比较

项目

内容

方法一

培养基上长出菌落→覆盖质量浓度过程

为1 mg/mL的CR溶液――――→倒去CR溶液→加入NaCl溶液―――→倒掉NaCl溶液→出现透明圈

优点

显示出颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用

操作简便，不存在菌落混杂问题

①由于琼脂、土豆汁中均含有淀粉类物质，制作繁琐，加入刚果红会使菌落之间发生混杂

可能使产生淀粉酶的微生物也形成透明圈，即假阳性反应；②有些微生物具有降解色素的能力，它们会降解刚果红形成透明圈，与纤维素分解菌不易区分

1.微生物体内能够使纤维素分解成纤维二糖的酶是(

) A.C1酶和CX酶

15 min10～15 min纤维素酶方法二

配制CR溶液→灭菌→按照1 mL CR/200 mL培养基比例混匀→倒平板→培养→出现透明圈

缺点

B.C1酶和葡萄糖苷酶

C.CX酶和葡萄糖苷酶

D.C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶

[问题导析]

纤维素是在C1酶和CX酶的作用下被分解为纤维二糖，葡萄糖苷酶可以将纤维二糖分解为葡萄糖。

答案

A 解析

纤维素酶属于复合酶，至少包含C1酶、CX酶和葡萄糖苷酶三种组分。其中C1酶和CX酶使纤维素分解成纤维二糖。

2.鉴定纤维素分解菌时，可以使用刚果红对其染色，刚果红染色法有两种常用方法，两种刚果红染色法的结果是(

) A.均会出现透明圈

B.方法一出现，方法二不出现

C.均不会出现透明圈

D.方法一不出现，方法二出现

[问题导析]

刚果红可以跟纤维素结合形成红色复合物，加入纤维素酶后纤维素被分解，不能形成红色复合物，从而出现透明圈。两种方法都能使纤维素分解，都能形成透明圈。

答案

A 解析

两种刚果红染色法染色的时间不同，但结果一样，均出现透明圈。

二

实验设计与操作提示

结合实验原理和教材给出的资料，完成下面的实验方案流程图。

1.实验过程分析

土壤取样：选择富含纤维素的环境，如树林中多年形成的腐殖土

↓



样品中分离到所需要的微生物操作方法：将20克土样，在无菌条件下加入选择培养可省略

装有30 mL选择培养基的锥形瓶中，将瓶

固定在摇床上，在一定温度下振荡培养

1～2 d，直至培养液变混浊，也可重复选择

培养↓

目的：增加纤维素分解菌的浓度，确保能够从

混匀成10倍稀释液

↓梯度稀释

混匀成10倍稀释液61 mL培养液＋9 mL蒸馏水

↓

涂布培养：将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上

↓

筛选菌株：刚果红染色法，挑选产生透明圈的菌落

↓

纯化培养

2.两种培养基

纤维素分解菌的选择培养基配方1

纤维素粉

NaNO3

Na2HPO4·7H2O KH2PO4

MgSO4·7H2O KCl 酵母膏

水解酪素

5 g 1 g 1.2 g 0.9 g 0.5 g 0.5 g 0.5 g 0.5 g 将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL

鉴别纤维素分解菌的培养基配方2

CMC－Na 酵母膏

KH2PO4

琼脂

土豆汁

5～10 g 1 g 0.25 g 15 g 100 mL

将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000 mL

(1)从功能上来看，培养基配方1为纤维素分解菌的选择培养基，该培养基中的唯一碳源是纤维素粉，只有能利用它的纤维素分解菌才能生存；培养基配方2为纤维素分解菌的鉴别培养

基。在该培养基中加入刚果红溶液，当培养基中长出菌落后，由于在该培养基上生长的只能是纤维素分解菌，能分泌纤维素酶，因此菌落周围会形成透明圈。

(2)从物理性质上来看，培养基配方1为纤维素分解菌的液体培养基，利用这种培养基可以增加纤维素分解菌的浓度；培养基配方2为纤维素分解菌的固体培养基，原因是添加了琼脂成分，需要在培养基上形成我们肉眼可见的菌落。

(3)若设置一个对照实验说明选择培养的作用，应控制的变量是将纤维素粉改为葡萄糖。

3.结果分析与评价

(1)培养基的制作是否合格：对照的培养基在培养过程中没有菌落生长，则说明培养基制作合格。

(2)选择培养基是否筛选出菌落：如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可能获得了分解纤维素的微生物。

(3)分解的结果是否一致：由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，学生也可能得到真菌和放线菌等不同的分离结果。

4.课题延伸

(1)为了确定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验，纤维素酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵两种。

(2)纤维素酶的测定方法：一般是采用对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖含量进行定量测定。

归纳提炼

纤维素分解菌的选择培养基和鉴别培养基的区别

(1)纤维素分解菌的选择培养基为液体培养基，因培养基中无凝固剂，利用液体选择培养基以增加纤维素分解菌的浓度。

(2)能产生纤维素酶的微生物能以纤维素作为碳源和能源，在培养基中正常生长，其他绝大多数生物不能正常生长。

(3)鉴别培养基中含有琼脂，为固体培养基，刚果红染色法应用的就是此培养基。

3.下列关于分离纤维素分解菌的实验的叙述，错误的是(

) A.经选择培养后将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上

B.选择培养这一步可省略，但培养纤维素分解菌少

C.经稀释培养后，用刚果红染色

D.对照组可用同样量的培养液涂布到不含纤维素的培养基上

[问题导析]

经选择培养后的样品需经梯度稀释后，才能涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基

上。

答案

A 解析

经选择培养后，再经稀释，才能将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上；选择培养可省略；经稀释培养后，用刚果红染色；设置对照能证明经选择培养的确得到了欲分离的微生物。

4.鉴别培养基是根据微生物的代谢特点在培养基中加入一些物质配制而成的，这些物质是(

) A.指示剂或化学药品

B.青霉素或琼脂

C.高浓度食盐

D.维生素或指示剂

[问题导析]

鉴别培养基是在培养基中加入某种试剂或化学药品，使培养后会发生某种变化，从而区别不同类型的微生物；培养基中加入青霉素或高浓度食盐的目的是抑制某些微生物的生长；琼脂为凝固剂。

答案

A 解析

在培养基中加入青霉素或高浓度食盐的目的是抑制某些微生物的生长，而加维生素一般是为微生物提供生长因子，起不到选择或鉴别作用，只有在加入某种指示剂或化学药品后，某些微生物会与特定的化学物质发生特定的化学反应，而表现出特有的菌落特征，我们可以根据这些特征去判断属于哪种微生物。