复习与测试特级教师教学实录

微生物的培养与应用

教学目标：

1.了解有关培养基的营养成分及作用；

2.掌握无菌操作技术；

3掌握培养基的制备过程和了解培养基的分类；

4掌握平板划线法和稀释涂布平板法等基本操作技术

5.理解分类纯化某种目的菌株的操作流程。

教学方法

1提问法与讨论法相结合，引导学生分析知识点，

2分析实验流程，对比前面的实验设计，归纳共性，分析差异，增加对知识点的掌握。

教学重点：

1．无菌技术的操作

2．平板划线法和稀释涂布平板法等基本操作技术

3．理解分类纯化某种目的菌株的操作流程。

教学难点：

1．无菌技术的操作

2．平板划线法和稀释涂布平板法等基本操作技术

3．理解分类纯化某种目的菌株的操作流程

教学过程：

引入新课

在传统发酵技术的应用中，都利用了微生物的发酵作用，其中的微生物来自于制作过程中的空气或原材料表面。而在工业化生产中，为了提高发酵的质量，需要获得优良菌种，并保持发酵菌种的纯度。这就要涉及到微生物的培养、分离、鉴别等基本技术。现在我们开始学习微生物的培养和应用专题。

新课过程：

一、微生物培养基的营养物质：

思考：培养基的营养成分有哪些？各成分有什么作用？

包括

水

、

无机盐

、

碳源

、

氮源

四类营养成分。

从细胞的化学元素组成来看，培养基中为什么都含有这些营养成分？

C、H、O、N、P、S是构成细胞原生质的基本元素，约占原生质总量的97％以上。

碳源：如CO2、糖类、脂肪酸等有机物，构成微生物的结构物质和分泌物，并提供能量。

氮源：如N2、氨盐、硝酸盐、牛肉膏、蛋白胨等，主要用来合成蛋白质、核酸及含氮代谢物等。含有C、H、O、N的化合物既可以作为碳源，又可以作为氮源，如氨基酸等。

培养基除满足微生物生长的pH、特殊营养物质和氧气等要求。

特殊营养物质即生长因子：某些微生物正常生长代谢过程中必须从培养基中吸收的微量有机小分子，如某些氨基酸、碱基、维生素等。

牛肉膏和蛋白胨主要为微生物提供糖、维生素和有机氮等营养物质。

培养乳酸杆菌时需要添加维生素，培养霉菌时需要将培养基pH调节为酸性，培养细菌时需要将pH调节为中性或微碱性。

二、无菌操作技术

思考:无菌操作技术的关键是什么？有哪些方法？消毒与灭菌各有哪些方法？

1．无菌技术包括：

（1）对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；

（2）将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌；

（3）为避免周围微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰附近旁进行；

（4）避免已灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。

2 比较消毒和灭菌（填表）

无菌技术除了防止培养物被污染外，还具有的目的是防止感染实验操作者

。

3 消毒方法：

（1）日常生活经常用到的是煮沸消毒法；

（2）对一些不耐高温的液体，则使用巴氏消毒法；

（3）对接种室、接种箱或超净工作台首先喷洒石炭酸或煤酚皂等溶液以增强消毒效果，然后使用紫外线进行物理消毒。

（4）实验操作者的双手使用酒精进行消毒；

（5）饮水水源用氯气进行消毒。

4灭菌方法：

（1）接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法；

（2）玻璃器皿、金属用具等使用干热灭菌法，所用器械是干热灭菌箱

；

（3）培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法，所用器械是高压蒸汽灭菌锅

。

（4）表面灭菌和空气灭菌等使用紫外线灭菌法，所用器械是紫外灯

。

注意1对接种环灭菌时要用酒精灯的充分燃烧层火焰灼烧可能伸入试管或培养皿的部位。

2利用干热灭菌箱对玻璃器皿灭菌时物品不能摆得太挤，目的是避免妨碍热空气流通。

3物品装入高压蒸汽灭菌锅灭菌后，要首先打开排气阀，煮沸并排除锅内冷空气，其目的是有利于锅内温度升高；随后关闭排气阀继续加热，气压升至100k Pa，温度为121℃

，并维持15～30 min；最后切断热源，使温度自然降温，气压务必降至零时打开锅盖，其目的是防止

容器中的液体暴沸。

三、培养基

思考：培养基的分类有哪些，各有什么用途？培养基制备是哪些环节？

1．基础知识

（1）培养基的种类包括固体培养基和液体培养基等。

琼脂是从红藻中提取的多糖，在配制培养基中用作为凝固剂

。

培养基的类型及其应用：

[来源学科网]标准

培养基类型

固体培养基

配制特点

加入琼脂较多

加入琼脂较少

不加入琼脂

由已知成分配制而成，培养基成分明确

添加某种指示剂或化学药剂

添加（或缺少）某种化学成分

主要应用

菌种分离,鉴定,计数

菌种保存

工业生产，连续培养

菌种分类、鉴定

菌种的鉴别

菌种的分离

物理性质

半固体培养基

液体培养基

化学组成

目的用途

合成培养基

天然培养基

鉴别培养基

选择培养基

由天然成分配制而成，培养基成分不明确

工业生，产降低成本

（2）培养基的配制原则：

①目的要明确：根据培养的微生物种类、培养的目的等确定培养基的类型和配制量。

②营养要协调：培养基中各种营养物质的浓度和比例要适宜。例如：碳氮比4∶1时，谷氨酸棒状杆菌大量繁殖而产生谷氨酸少；碳氮比为3∶1时，菌体繁殖受抑制而谷氨酸合成量大增。

③pH要适宜：细菌培养基pH中性或偏碱性，霉菌培养基呈酸性。

2．实验操作

（1）计算：根据配方比例，计算100mL培养基各成分用量。

（2）

称量：准确称取各成分。称取牛肉膏和蛋白胨时动作要迅速，目的是防止牛肉膏吸

收空气中水分。

（3）

溶化：①加水加热熔化牛肉膏；②加入蛋白胨和氯化钠继续加热；③加入琼脂；④用蒸馏水定容到100mL。整个过程不断用玻棒搅拌，目的是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。

（4）

调pH：用1mol/LNaOH溶液调节pH至偏碱性。

（5）

灭菌：将配制好的培养基转移到锥形瓶中，加塞包扎后用高压蒸汽灭菌锅灭菌；所用培养皿用报纸包扎后用干热灭菌箱灭菌。

（6）

倒平板：待培养基冷却至50℃左右时在酒精灯火焰附近操作进行。

其过程是：

①在火焰旁右手拿锥形瓶，左手拔出棉塞；②右手拿锥形瓶，使锥形瓶的瓶口迅速通过火焰；③左手将培养皿打开一条缝隙，右手将培养基倒入培养皿，立刻盖上皿盖。④待平板冷却凝固后，将平板倒过来放置。

注意：1锥形瓶的瓶口通过火焰的目的是消灭瓶口的杂菌，防止杂菌感染培养基。

2倒平板的目的是防止培养基冷却过程中形成的水滴落到培养基表面。

3配制斜面培养基中，试管要加塞棉塞的目的是保持通气并防止杂菌感染。

4试管培养基形成斜面的作用是增大接种面积。

思考：若皿盖和皿底之间粘有培养基，则该平板能否培养微生物？为什么？

不能。空气中杂菌会在这些粘附培养基上繁殖，并污染皿内培养基。

四、平板划线法和稀释涂布平板法

1．微生物接种的常用方法是平板划线法和稀释涂布法，另外还有穿刺接种和斜面接种等。

2．平板划线法：通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基表面。其操作步骤是：

①将接种环在酒精灯火焰上灼烧直至烧红。

②在酒精灯火焰旁冷却接种环，并打开大肠杆菌的菌种试管的棉塞。

③将菌种试管口通过火焰达到消灭试管口杂菌的目的。

④将冷却的接种环伸入到菌液中取出一环菌种。

⑤将菌种试管口再次通过火焰后塞上棉塞。

⑥将皿盖打开一条缝隙，把接种环伸入平板内划3～5条平行线，盖上皿盖，不要划破培养基。

⑦灼烧接种环，冷却后从第一区划线末端开始向第二区域内划线。重复上述过程，完成三、四、五区域内划线。注意不要将第五区的划线与第一区划线相连。

⑧将平板倒置放在培养箱中培养。

注意：取菌种前灼烧接种环的目的是消灭接种环上的微生物；除第一次划线外，其余划线前都要灼烧接种环的目的是消灭接种环上残留菌种；取菌种和划线前都要求接种环冷却后进行，其目的是防止高温杀死菌种；最后灼烧接种环的目的是防止细菌污染环境和操作者。

在第1次划线后都从上次划线末端开始的目的是获得由单个细菌形成的标准菌落。

3．稀释涂布平板法：将菌液进行一系列梯度稀释，并将不同稀释度菌液分别涂布到琼脂固体培养基上进行培养。当稀释倍数足够高时，即可获得单个细菌形成的标准菌落。

4．系列稀释操作：

①取盛有9mL水的无菌试管6支，编号101、102、103、104、105、106。

②用灼烧冷却的移液管吸取1mL菌液注入编号为101试管中，并吹打3次，使之混匀。

③从101倍液中吸取1mL菌液注入到编号为102试管内吹打均匀，获得102倍液。依此类推。

操作中试管口和移液管应在离火焰1～2cm处。整个操作过程中使用了1支移液管。

5．结果分析与评价

（1）培养未接种培养基的作用是对照，若有菌落形成，说明培养基灭菌不彻底。

（2）在肉汤培养基上，大肠杆菌菌落呈白色，为圆形，光滑有光泽，边缘整齐。

（3）培养12h和24h后的菌落大小不同（相同、不同）；菌落分布位置相同（相同、不同）。

原因是时间越长，菌落中细菌繁殖越多，菌落体积越大；菌落的位置不动，但菌落数增多。

在某培养基上出现了3种特征不同的菌落，原因有培养基灭菌不彻底或杂菌感染等。

频繁使用的菌种利用临时保藏法保存，长期保存菌种的方法是甘油管藏法。前者利用固体斜面培养基培养后，保存在4℃冰箱中，每3～6个月转种培养一次，缺点是保存时间较短，容易发生污染和变异；后者将菌种与无菌体积等量混合后保存在－20℃冷冻箱中。

五、获取某种目的菌的操作过程

1.分离分解尿素的细菌和分解纤维素的微生物的操作流程分别是什么？

2．分离获得某种目的菌株的大致环节：

获取土壤溶液-------选择培养--------稀释涂布鉴别------挑选菌落---纯化即可

3.目的菌株能力的检测：

（1）测定反应物的残留量：残留量越少，说明目的菌株分解能力越强。

（2）测定反应物被目的菌分解后的产物数量。目的菌株的分解能力与产物量正相关。

（3）测定目的菌株分解物质时，分泌的酶的活性检测。

六、课堂板书

一、培养基的营养成分及作用；

二、无菌操作技术；

三、培养基的制备过程和了解培养基的分类；

四、平板划线法和稀释涂布平板法等基本操作技术

五、分离纯化某种目的菌株的操作流程。

七、课堂小结

1.了解有关培养基的营养成分及作用；

2.掌握无菌操作技术；

3掌握培养基的制备过程和了解培养基的分类；

4掌握平板划线法和稀释涂布平板法等基本操作技术

5.理解分类纯化某种目的菌株的操作流程。

八、课后作业

完成世纪金榜的相关练习